線粒體分裂抑制線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的形成促進(jìn)肝癌細(xì)胞的存活
發(fā)布時間：2021-09-04 21:43
研究目的:1.觀察線粒體分裂對線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAMs）結(jié)構(gòu)及功能的影響;2.探討MAMs對肝癌細(xì)胞生長的影響;3.分析線粒體分裂通過Rab32對MAMs結(jié)構(gòu)及肝癌細(xì)胞生存的影響。研究方法:1.利用透射電子顯微鏡觀察肝癌與癌旁組織中MAMs數(shù)量的變化;利用Kaplan-Meier曲線分析MAMs數(shù)量與肝癌患者預(yù)后的關(guān)系;通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建Drp1干涉/過表達(dá)細(xì)胞株,利用Western blot和激光共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果;利用Cell light?ER-RFP和Mitotacker Green染料分別標(biāo)記內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,通過超高分辨率顯微鏡觀察過表達(dá)Drp1后線粒體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的共定位情況,利用Rhod-2染料檢測過表達(dá)Drp1對線粒體內(nèi)Ca2+濃度的影響;2.通過脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染法構(gòu)建PACS-2干涉的細(xì)胞株,利用Western blot觀察干涉效果,并利用電鏡觀察干涉PACS-2后對MAMs結(jié)構(gòu)的影響,進(jìn)一步通過EDU和流式細(xì)胞術(shù),檢測干涉PACS-2對肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響;3.利用Percoll離心法分離亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),通過Western blot檢測這些...
【文章來源】：延安大學(xué)陜西省
【文章頁數(shù)】：73 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
線粒體形態(tài)（引自文獻(xiàn)[8]）
線粒體分裂抑制線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的形成促進(jìn)肝癌細(xì)胞的存活-3-和MiD51（mitochondrialelongationfactor1）[16-18]）的協(xié)助，共同介導(dǎo)線粒體的分裂過程。線粒體融合調(diào)控分子：與線粒體的分裂不同，線粒體融合有兩個不同的系統(tǒng)來融合內(nèi)膜和外膜，即使這些過程是分開的，內(nèi)膜和外膜的融合也是高度協(xié)調(diào)的[8]。通過MFN1（mitofusin1）和MFN2（mitofusin）可以實現(xiàn)線粒體外膜的融合，而通過視神經(jīng)萎縮蛋白1（opticatrophy1，OPAl）可以實現(xiàn)線粒體內(nèi)膜的融合[27-29]。目前已有研究表明線粒體融合蛋白受蛋白水解和泛素化的調(diào)控。線粒體外膜融合蛋白主要是通過泛素化介導(dǎo)的降解失活調(diào)節(jié)其功能[30]；而線粒體內(nèi)膜融合蛋白的功能在少數(shù)幾個位點被蛋白水解所改變[31]。圖2.線粒體分裂和融合蛋白示意圖（引自文獻(xiàn)[22]）。（A）哺乳動物中主要Dynamin家族成員Drp1、Mfn1、Mfn2和OPA1分子結(jié)構(gòu)；（B）可與Drp1結(jié)合的受體蛋白結(jié)構(gòu)；（C）Drp1及其線粒體表面受體。1.2.2線粒體分裂的分子機(jī)制在動物細(xì)胞中，線粒體具有較寬的直徑，通過多種機(jī)制依次驅(qū)動ER相關(guān)的線粒體外膜收縮和分裂過程。首先，線粒體被肌動蛋白-肌球蛋白通過ER定位的反式INF2蛋白和線粒體定位的Spire1c蛋白聚集到MCSs中收縮[32,33]。接下來，線粒體動力蛋白Drp1被募集到ER標(biāo)記的線粒體收縮處，Drp1與受體蛋白（MFF、MiD49和Mid51）結(jié)合使Drp1從細(xì)胞質(zhì)募集到線粒體表面[17,34,35]。Drp1在線粒體外膜周圍寡聚，然后以GTPase依賴性方式驅(qū)動線粒體收縮[21]。Drp1可以將線粒體收縮至<50nm，這時招募另一種動力蛋白家族成員Dnm2，以完成線粒體的最終分裂[18]（圖1-3）。
引言-4-1.2.3線粒體融合的分子機(jī)制融合是從兩個MFN1分子反式對接開始，可能通過HR2域或GTPase域；這種結(jié)合會誘導(dǎo)構(gòu)象變化，驅(qū)動MFN1分子水解GTP，從而導(dǎo)致兩個OMM的融合[36]。在線粒體內(nèi)膜中，未經(jīng)加工的OPA1形式（稱為長OPA1）與脂質(zhì)心磷脂反式相互作用，從而使OPA1具有融合能力[37]。這種結(jié)合是在短OPA1存在下促進(jìn)的，這是由長OPA1的蛋白降解產(chǎn)生的。融合還需要另一個線粒體融合蛋白MFN2，但在此過程中其機(jī)制尚不清楚（它是線粒體與其他細(xì)胞器之間的固定系鏈，主要是ER）[19,38]（圖3）。圖3.線粒體分裂融合分子機(jī)制（引自文獻(xiàn)[39]）1.2.4線粒體動力學(xué)與腫瘤發(fā)生進(jìn)展的關(guān)系許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中線粒體分裂增強(qiáng)，且可能在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用[40]。例如JingGuo等通過組織學(xué)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境增加了Drp1的激活，導(dǎo)致葡萄糖代謝改變、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）增加、遷移和侵襲。而高糖引起的所有這些變化可以通過Drp1敲低得到部分緩解[41]；Jingliang等發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，Drp1在胰腺癌組織和細(xì)胞中顯著升高，抑制Drp1活性可顯著抑制
本文編號：3384060
【文章來源】：延安大學(xué)陜西省
【文章頁數(shù)】：73 頁
【學(xué)位級別】：碩士
【部分圖文】：
線粒體形態(tài)（引自文獻(xiàn)[8]）
線粒體分裂抑制線粒體相關(guān)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的形成促進(jìn)肝癌細(xì)胞的存活-3-和MiD51（mitochondrialelongationfactor1）[16-18]）的協(xié)助，共同介導(dǎo)線粒體的分裂過程。線粒體融合調(diào)控分子：與線粒體的分裂不同，線粒體融合有兩個不同的系統(tǒng)來融合內(nèi)膜和外膜，即使這些過程是分開的，內(nèi)膜和外膜的融合也是高度協(xié)調(diào)的[8]。通過MFN1（mitofusin1）和MFN2（mitofusin）可以實現(xiàn)線粒體外膜的融合，而通過視神經(jīng)萎縮蛋白1（opticatrophy1，OPAl）可以實現(xiàn)線粒體內(nèi)膜的融合[27-29]。目前已有研究表明線粒體融合蛋白受蛋白水解和泛素化的調(diào)控。線粒體外膜融合蛋白主要是通過泛素化介導(dǎo)的降解失活調(diào)節(jié)其功能[30]；而線粒體內(nèi)膜融合蛋白的功能在少數(shù)幾個位點被蛋白水解所改變[31]。圖2.線粒體分裂和融合蛋白示意圖（引自文獻(xiàn)[22]）。（A）哺乳動物中主要Dynamin家族成員Drp1、Mfn1、Mfn2和OPA1分子結(jié)構(gòu)；（B）可與Drp1結(jié)合的受體蛋白結(jié)構(gòu)；（C）Drp1及其線粒體表面受體。1.2.2線粒體分裂的分子機(jī)制在動物細(xì)胞中，線粒體具有較寬的直徑，通過多種機(jī)制依次驅(qū)動ER相關(guān)的線粒體外膜收縮和分裂過程。首先，線粒體被肌動蛋白-肌球蛋白通過ER定位的反式INF2蛋白和線粒體定位的Spire1c蛋白聚集到MCSs中收縮[32,33]。接下來，線粒體動力蛋白Drp1被募集到ER標(biāo)記的線粒體收縮處，Drp1與受體蛋白（MFF、MiD49和Mid51）結(jié)合使Drp1從細(xì)胞質(zhì)募集到線粒體表面[17,34,35]。Drp1在線粒體外膜周圍寡聚，然后以GTPase依賴性方式驅(qū)動線粒體收縮[21]。Drp1可以將線粒體收縮至<50nm，這時招募另一種動力蛋白家族成員Dnm2，以完成線粒體的最終分裂[18]（圖1-3）。
引言-4-1.2.3線粒體融合的分子機(jī)制融合是從兩個MFN1分子反式對接開始，可能通過HR2域或GTPase域；這種結(jié)合會誘導(dǎo)構(gòu)象變化，驅(qū)動MFN1分子水解GTP，從而導(dǎo)致兩個OMM的融合[36]。在線粒體內(nèi)膜中，未經(jīng)加工的OPA1形式（稱為長OPA1）與脂質(zhì)心磷脂反式相互作用，從而使OPA1具有融合能力[37]。這種結(jié)合是在短OPA1存在下促進(jìn)的，這是由長OPA1的蛋白降解產(chǎn)生的。融合還需要另一個線粒體融合蛋白MFN2，但在此過程中其機(jī)制尚不清楚（它是線粒體與其他細(xì)胞器之間的固定系鏈，主要是ER）[19,38]（圖3）。圖3.線粒體分裂融合分子機(jī)制（引自文獻(xiàn)[39]）1.2.4線粒體動力學(xué)與腫瘤發(fā)生進(jìn)展的關(guān)系許多研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中線粒體分裂增強(qiáng)，且可能在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用[40]。例如JingGuo等通過組織學(xué)和體外實驗發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境增加了Drp1的激活，導(dǎo)致葡萄糖代謝改變、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）增加、遷移和侵襲。而高糖引起的所有這些變化可以通過Drp1敲低得到部分緩解[41]；Jingliang等發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，Drp1在胰腺癌組織和細(xì)胞中顯著升高，抑制Drp1活性可顯著抑制
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