研究背景:THAP（Thanatos-Associated protein）蛋白家族,因其N端共有一個在進化上高度保守的THAP鋅指結(jié)構域而得名。許多THAP蛋白家族成員作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用,參與細胞的增殖、凋亡、血管生成等過程。THAP8是THAP家族的一個新成員,其表達和功能尚不清楚。本文主要研究THAP8基因的表達、調(diào)控及其功能。研究方法:通過TCGA數(shù)據(jù)庫和Oncomine數(shù)據(jù)庫的分析,發(fā)現(xiàn)THAP8在癌組織中的表達高于正常組織,然后利用熒光定量PCR分析了22對肺癌和癌旁組織中的THAP8的表達。利用Western blotting檢測分析THAP8蛋白在人類正常肺細胞系Beas-2B和幾種肺癌細胞系中的THAP8蛋白表達水平。利用過JASPAR軟件分析,發(fā)現(xiàn)THAP8基因啟動子區(qū)含有4個缺氧反應元件（HRE）,然后利用熒光素酶實驗和Co Cl2誘導缺氧實驗,分析缺氧誘導因子α（HIF1α）對THAP表達的調(diào)控作用。利用慢病毒系統(tǒng)干擾THAP8基因的表達,采用MTT細胞增殖實驗、劃痕實驗、克隆形成實驗、侵襲實驗等分析了THAP8基因沉默對肺癌細胞生物學行為的影響。研究結(jié)果:1... 

【文章來源】：湖南師范大學湖南省 211工程院校

【文章頁數(shù)】：53 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

人THAP蛋白家族成員結(jié)構模式圖

碩士學位論文22圖3-1THAP8在肺癌組織中的表達高于正常肺組織（A、B）利用TCGA數(shù)據(jù)庫（A）及Oncomine數(shù)據(jù)庫(B)分析了在肺癌組織和正常組織中THAP8基因的表達差異；（C）取22對臨床樣本分析，熒光定量PCR數(shù)據(jù)顯示THAP8基因mRNA水平表達在肺癌組織和癌旁組織中存在明顯的差異性，用GraphPad軟件分析并計算具有顯著性差異,N:正常組織，C:癌組織；（D）采用β-actin作為內(nèi)參蛋白，重復三次用蛋白質(zhì)印記技術檢測了各肺細胞系中（95-D、Beas-2B、A549、H358、H446、H1437和H460）THAP8在蛋白水平表達的差異;（E）用GraphPad軟件分析三次蛋白質(zhì)印記實驗結(jié)果，做灰度統(tǒng)計分析。

碩士學位論文24圖3-2HIF1α調(diào)控THAP8基因的表達（A）表示THAP8基因啟動子的部分序列，下劃線標示的即是HRE位點；(B)HIF1α對THAP8轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，在Hek293細胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，24小時后進行熒光素酶檢測分析；（C）用CoCl2誘導Beas-2B細胞缺氧，從而誘導HIF1α的表達，WB檢測THAP8的蛋白表達變化，用β-actin作為內(nèi)參蛋白。3.3干擾THAP8對肺癌細胞的增殖、克隆形成、遷移和侵襲的影響3.3.1干擾THAP8細胞系的構建為了更進一步研究THAP8在肺癌中生物學的功能，我們首先構建了THAP8shRNA的表達載體，并包裝成慢病毒顆粒。共設計了四個靶位點（THAP8基因干擾位點如表3-1所示），首先在95-D細胞中檢驗干擾效果，由于購買的THAP8干擾慢病毒帶有紅色熒光標記，因此可在感染72小時后在熒光顯微鏡觀察感染效率的高低，從而采用適當?shù)泥堰拭顾貪舛扰囵B(yǎng)篩選陽性細胞，最終獲得THAP8低表達的穩(wěn)定細株，經(jīng)過反復的檢測與分析，最終發(fā)現(xiàn)HSH004706-32-LVRH1MP和HSH004706-33-LVRH1MP這兩個慢病毒的干擾效果最佳（圖3-3A），因此在后文中采用這兩個慢病毒對THAP8進行干擾（分別命名為sh-1和sh-2）。在分析了各種肺癌細胞系中THAP8基因的表達情況后，我們選取了THAP8

【參考文獻】：
期刊論文
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本文編號：3254984