Dhh信號(hào)通路調(diào)控生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)
發(fā)布時(shí)間：2021-06-24 20:05
目的:利用Desert Hedgehog（Dhh）信號(hào)通路抑制劑Cyclopamine和激動(dòng)劑Smoothened agonist（SAG）,探討Dhh信號(hào)通路對(duì)生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響及作用機(jī)制。方法:將10日齡小鼠睪丸消化細(xì)胞進(jìn)行三維（3 dimensions,3D）立體培養(yǎng),通過添加Dhh信號(hào)通路阻斷劑Cyclopamine、激動(dòng)劑SAG,利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)支持細(xì)胞（Sertoli cells,SC）、管周肌樣細(xì)胞（Peritubular myoid cells,PTM）、睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells,LC）、生殖細(xì)胞（Germ cells,GC）和層粘連蛋白來觀察生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)情況;利用活細(xì)胞工作站觀察生精小管樣結(jié)構(gòu)形成過程;利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)睪丸間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、管周肌樣細(xì)胞、生殖細(xì)胞的增殖情況;用Real-time PCR檢測(cè)Dhh信號(hào)通路下游信號(hào)分子mRNA表達(dá)水平;用Western Blot（WB）檢測(cè)Dhh信號(hào)通路下游信號(hào)分子蛋白的表達(dá)水平,探討Dhh信號(hào)通路在生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的作用及機(jī)制。結(jié)果:添加抑制劑Cyclopamine后,免疫熒光結(jié)果...
【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省
【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
Hedgehog信號(hào)通路圖
4 種濃度，激動(dòng)劑 SAG 設(shè)置 2.5μM、5μM 2 種濃度來篩選最佳實(shí)驗(yàn)濃度。培養(yǎng) 7天后進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖（圖 1-1）所示，與陽性對(duì)照 KSR+DMF 組相比，隨著 Cyclopamine 濃度的增高，支持細(xì)胞逐漸失去極性，管周肌樣細(xì)胞形狀為圓形（圖 1-1 B-D）。與陰性對(duì)照 DMSO 組相比，使用 2.5μM SAG，形態(tài)學(xué)變化不明顯（圖 1-1 G）。但是當(dāng) SAG 濃度達(dá)到 5μM，部分支持細(xì)胞表現(xiàn)出極性，管周肌樣細(xì)胞伸長(zhǎng)呈紡錘狀，位于支持細(xì)胞基底部（圖 1-1 H）。并且，1‰濃度的 DMSO 和 DMF 不影響生精小管重構(gòu)（圖 1-1 E, I）。因此，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)Cyclopamine 的濃度為 20μM，SAG 的濃度為 5μM。
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文閔明25結(jié)果如圖（圖2-1）所示，添加抑制劑Cyclopamine后支持細(xì)胞不表現(xiàn)出極性，細(xì)胞長(zhǎng)軸朝向任意方向；管周肌樣細(xì)胞基本呈圓形，散在分布（圖2-1B）；睪丸間質(zhì)細(xì)胞也零散分布（圖2-1E）。而陽性對(duì)照組中支持細(xì)胞表現(xiàn)出極性，其頂端朝向管腔；管周肌樣細(xì)胞伸長(zhǎng)呈扁形，附著在支持細(xì)胞的基底部（圖2-1C）；睪丸間質(zhì)細(xì)胞基本在管周肌樣細(xì)胞的外側(cè)聚集（圖2-1F）。在正常的生精小管中，支持細(xì)胞會(huì)分泌Laminin,沉積于其基底部，參與形成基膜。在Cyclopamine作用下，Laminin的分泌明顯受到抑制（圖2-1H）。圖2-1：抑制劑對(duì)生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響.A-C中支持細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，管周肌樣細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。D-F中管周肌樣細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。G-I中支持細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，laminin呈現(xiàn)綠色熒光。(×200)Fig.2-1:Theeffectofinhibitoronthereconstructionoftubule-likestructure.(A–C)SCandPTMweremarkedbySOX-9(green)andα-SMA(red).(D–F)PTMandLCweremarkedbyα-SMA(red)and3β-HSD(green).(G–I)AnalysistheexpressionoflamininandthelocalizationofSCbystainingwithanti-laminin(green)andanti-GATA4(red)antibody.Scalebar=50μm.3.2.2抑制劑對(duì)生殖細(xì)胞的影響
本文編號(hào)：3247744
【文章來源】：遵義醫(yī)科大學(xué)貴州省
【文章頁(yè)數(shù)】：60 頁(yè)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【部分圖文】：
Hedgehog信號(hào)通路圖
4 種濃度，激動(dòng)劑 SAG 設(shè)置 2.5μM、5μM 2 種濃度來篩選最佳實(shí)驗(yàn)濃度。培養(yǎng) 7天后進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果如圖（圖 1-1）所示，與陽性對(duì)照 KSR+DMF 組相比，隨著 Cyclopamine 濃度的增高，支持細(xì)胞逐漸失去極性，管周肌樣細(xì)胞形狀為圓形（圖 1-1 B-D）。與陰性對(duì)照 DMSO 組相比，使用 2.5μM SAG，形態(tài)學(xué)變化不明顯（圖 1-1 G）。但是當(dāng) SAG 濃度達(dá)到 5μM，部分支持細(xì)胞表現(xiàn)出極性，管周肌樣細(xì)胞伸長(zhǎng)呈紡錘狀，位于支持細(xì)胞基底部（圖 1-1 H）。并且，1‰濃度的 DMSO 和 DMF 不影響生精小管重構(gòu)（圖 1-1 E, I）。因此，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)Cyclopamine 的濃度為 20μM，SAG 的濃度為 5μM。
遵義醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文閔明25結(jié)果如圖（圖2-1）所示，添加抑制劑Cyclopamine后支持細(xì)胞不表現(xiàn)出極性，細(xì)胞長(zhǎng)軸朝向任意方向；管周肌樣細(xì)胞基本呈圓形，散在分布（圖2-1B）；睪丸間質(zhì)細(xì)胞也零散分布（圖2-1E）。而陽性對(duì)照組中支持細(xì)胞表現(xiàn)出極性，其頂端朝向管腔；管周肌樣細(xì)胞伸長(zhǎng)呈扁形，附著在支持細(xì)胞的基底部（圖2-1C）；睪丸間質(zhì)細(xì)胞基本在管周肌樣細(xì)胞的外側(cè)聚集（圖2-1F）。在正常的生精小管中，支持細(xì)胞會(huì)分泌Laminin,沉積于其基底部，參與形成基膜。在Cyclopamine作用下，Laminin的分泌明顯受到抑制（圖2-1H）。圖2-1：抑制劑對(duì)生精小管樣結(jié)構(gòu)重構(gòu)的影響.A-C中支持細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，管周肌樣細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。D-F中管周肌樣細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，睪丸間質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。G-I中支持細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光，laminin呈現(xiàn)綠色熒光。(×200)Fig.2-1:Theeffectofinhibitoronthereconstructionoftubule-likestructure.(A–C)SCandPTMweremarkedbySOX-9(green)andα-SMA(red).(D–F)PTMandLCweremarkedbyα-SMA(red)and3β-HSD(green).(G–I)AnalysistheexpressionoflamininandthelocalizationofSCbystainingwithanti-laminin(green)andanti-GATA4(red)antibody.Scalebar=50μm.3.2.2抑制劑對(duì)生殖細(xì)胞的影響
本文編號(hào)：3247744
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