目的研究HSC中TGF-β1通過(guò)smad3對(duì)IL-1R1及IL-1β的影響。方法構(gòu)建轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β1的短發(fā)卡RNA（shRNA）及陰性對(duì)照質(zhì)粒組裝入慢病毒載體,分別轉(zhuǎn)染至大鼠肝星狀細(xì)胞系HSC-T6細(xì)胞,篩選出穩(wěn)定干擾細(xì)胞株,并分別命名為T(mén)GF-β1-KD組和Ctrl-KD組。用細(xì)胞因子TGF-β1 12ng/ml刺激HSC細(xì)胞和TGF-β1-KD細(xì)胞,即實(shí)驗(yàn)分為五組:A:HSC組、B:HSC+TGF-β1組、C:Ctrl-KD組、D:TGF-β1-KD組、E:TGF-β1-KD+TGF-β1組。細(xì)胞培養(yǎng)48h后,提取各組總RNA、總蛋白采用q-PCR、Western-blot檢測(cè)IL-1R1、IL-1β、α-SMA的表達(dá)情況。為了探討smad3在其中的作用,在B組的基礎(chǔ)上使用smad3抑制劑（SIS3）提前2h處理HSC,采用Western-blot檢測(cè)IL-1R1和IL-1β的變化。為了進(jìn)一步探討IL-1β對(duì)HSC的活化是否依賴TGF-β1,我們用12ng/ml的TGF-β1和IL-1β細(xì)胞因子分別處理A組和D組細(xì)胞,采用Western-blot檢測(cè)α-SMA和Col-Ⅰ的... 

【文章來(lái)源】：重慶醫(yī)科大學(xué)重慶市

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

構(gòu)建干擾的TGF-β1病毒載體Fig1.Thelentiviralvector

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文23TGF-β1-KD組中TGF-β1的mRNA水平(0.110±0.018)較Ctrl-KD組(1.158±0.170)明顯降低（p<0.001），且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，提取三組細(xì)胞總蛋白，Western-blot檢測(cè)TGF-β1蛋白表達(dá)情況（圖1c），結(jié)果提示：TGF-β1-KD組中TGF-β1的蛋白表達(dá)（0.417±0.042）較Ctrl-KD組（2.102±0.016）和HSC組（2.417±0.136）明顯降低（P<0.001），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這說(shuō)明HSC中的TGF-β1的表達(dá)被成功干擾。圖2慢病毒對(duì)TGF-β1的干擾Fig2.GenesilencingofTGF-β1byshRNA.n=3，***P<0.001,ascomparedtotheCtrl-KDgroup.4.2TGF-β1下調(diào)HSC中IL-1R1的表達(dá)4.2.1q-PCR檢測(cè)TGF-β1對(duì)IL-1R1的表達(dá)的影響以相同的細(xì)胞濃度培養(yǎng)HSC組、Ctrl-KD組、TGF-β1-KD組細(xì)胞于T25培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后用12ng/ml的人重組細(xì)胞因子TGF-β1刺激HSC組、TGF-β1-KD

重慶醫(yī)科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文25圖4TGF-β1對(duì)IL-1R1蛋白表達(dá)的影響Fig4.EffectofTGF-β1ontheexpressionofIL-1R1protein（n=3，**=P<0.01，***=P<0.001）4.3TGF-β1通過(guò)smad3調(diào)節(jié)IL-1R1的表達(dá)TGF-β/smads信號(hào)通路是TGF-β1傳導(dǎo)的重要信號(hào)通路，smad3在此通路中扮演著重要作用。在胰腺星狀細(xì)胞中，TGF-β1對(duì)IL-1R1的抑制作用已廣為研究，因此在肝星狀細(xì)胞中我們使用smad3抑制劑（SIS3）抑制smad3的磷酸化，觀察TGF-β1對(duì)IL-1R1的作用。如圖5中顯示加TGF-β1刺激48h后IL-1R1的表達(dá)量（0.654±0.142）較未處理組（1.442±0.376）下降（P<0.05），提前用抑制劑SIS3處理2小時(shí)再加TGF-β1刺激后IL-1R1的表達(dá)量（1.645±0.226）較TGF-β1處理組（0.654±0.142）增加（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于IL-1R1主要配體是IL-1β蛋白，因此我們還檢測(cè)了IL-1β的變化（圖5），結(jié)果提示：抑制劑SIS3和TGF-β1共同處理后IL-1β的表達(dá)量（0.456±0.179）較TGF-β1單獨(dú)處理組（0.082±0.013）增加（P<0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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本文編號(hào)：3237081