發(fā)布時間：2020-11-18 22:17

　　 目的:納米氧化鋁由于其優(yōu)良的物理化學性質,在光電子、催化劑、工程、醫(yī)藥等領域得到了廣泛的應用。在生產過程中,納米氧化鋁可在產品制造、加工和廢物排放等過程中直接或間接釋放到環(huán)境中。當生物體內蓄積納米氧化鋁顆粒在達到一定閾值后可能會出現(xiàn)毒性效應。然而,現(xiàn)有的毒理學證據很難確切地評估納米氧化鋁對水生生物和人體的潛在風險。因此,本研究旨在探討納米氧化鋁對成年斑馬魚學習和記憶能力的影響。方法:采用不同濃度(0、6.25、12.5、25.0、50.0、100 mg/L)的13 nm粒徑的氧化鋁處理受精后6 h的斑馬魚胚胎至受精后120 h結束,并在成年時(6、9和12月齡)檢測其神經行為學指標,評價學習記憶能力;本研究設計了一組實驗來評估斑馬魚胚胎期接觸納米氧化鋁是否會蓄積在大腦組織中并對其學習和記憶能力造成損害。我們用電子顯微鏡觀察了納米氧化鋁的表征,并用納米粒度儀測定了Zeta電位。采用焦慮活動檢測試驗、探索活動檢測試驗和T迷宮試驗,觀察了成年斑馬魚6、9和12月齡的神經行為和學習記憶變化。此外,測定了腦組織中乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)等神經遞質生物標志物,活性氧(ROS)、乳酸脫氫酶(LDH)等氧化應激標志物。另外,使用尼氏染色法檢測了腦組織神經細胞數(shù)目變化,通過電鏡觀察了腦組織亞細胞結構的病理形態(tài)改變,RT-PCR檢測了自噬相關基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表達,使用ICP-MS檢測了斑馬魚腦組織鋁的蓄積變化。結果:(1)腦鋁含量增加:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6和12月齡的斑馬魚腦組織中鋁含量增加,且存在劑量依賴效應,腦鋁含量隨劑量增加而升高。(2)焦慮樣行為加重:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6、9和12月齡的斑馬魚焦慮樣行為增加,包括平均速度和外區(qū)累積時間百分比顯著減少,凍結時間移動率增加。且存在劑量和年齡依賴效應,隨劑量和年齡增加,焦慮樣行為逐漸加重。(3)新環(huán)境的探索行為減弱:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6、9和12月齡的斑馬魚對新環(huán)境的探索行為減弱,且存在劑量和年齡依賴效應,隨劑量和年齡增加,探索行為逐漸減弱。(4)記憶能力降低:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6和12月齡的斑馬魚學習記憶能力降低,且存在劑量和年齡依賴效應,包括潛伏期增加和累積停留時間減少。隨劑量和年齡增加,學習記憶能力出現(xiàn)進行性損傷。(5)神經遞質含量降低:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6和12月齡的斑馬魚腦組織神經遞質含量降低,包括乙酰膽堿(ACh)和多巴胺(DA)的水平顯著下降。(6)氧化應激反應加重:納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致6和12月齡的斑馬魚腦組織氧化應激反應加重,包括活性氧(ROS)和乳酸脫氫酶(LDH)的水平顯著增加。(7)納米氧化鋁斑馬魚胚胎暴露,導致斑馬魚腦組織神經細胞數(shù)目減少且伴隨著自噬的發(fā)生,以及腦組織中自噬相關基因(ULK1、LC3-Ⅱ、Beclin-1)的表達上調。結論:納米氧化鋁在6.25 mg/L至100 mg/L的暴露濃度范圍內對斑馬魚具有神經毒性,我們發(fā)現(xiàn)低濃度(6.25 mg/L)的納米氧化鋁對6個月齡前的斑馬魚比較安全。隨著暴露劑量和持續(xù)時間的增加,包括低濃度(6.25 mg/L)在內的所有劑量的納米氧化鋁都會引起斑馬魚學習和記憶的不良影響。斑馬魚胚胎期接觸納米氧化鋁對斑馬魚腦組織中的鋁含量具有劑量和年齡依賴性,并且隨著劑量和年齡的增加而顯著增加。暴露于納米氧化鋁會導致進行性神經行為改變,學習記憶能力進行性損傷。它還會導致斑馬魚腦組織中產生氧化應激和多巴胺能傳遞受到破壞,腦組織中神經細胞的數(shù)量顯著減少且伴隨著自噬的發(fā)生。
【學位單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2020
【中圖分類】：R114
【部分圖文】：

山西醫(yī)科大學碩士學位論文81.4.3納米氧化鋁暴露本項研究由1個對照組和5個暴露組組成。將6hpf的對照組置于斑馬魚胚胎培養(yǎng)基中，每日更換胚胎培養(yǎng)液一次。各實驗組暴露于不同濃度（0、6.25、12.5、25.0、50.0、100mg/L）的納米氧化鋁懸濁液中，每天更換新的納米氧化鋁懸濁液一次。實驗在28.5℃恒溫孵育箱中進行，光/暗循環(huán)14/10小時。每12h檢查各組胚胎發(fā)育情況，及時取出卵凝結的胚胎和死亡幼體。120hpf停止暴露納米氧化鋁。每個暴露劑量組和對照組分別選取70顆魚卵進行培養(yǎng)，6月齡時，排除生長過程中一些不可控因素導致的個別斑馬魚的死亡影響，每組剩余約60條成魚，這些成年魚被用于檢測斑馬魚學習記憶能力損傷及其機制。在斑馬魚成魚6、9和12月齡時檢測各種實驗指標，包括：腦鋁含量（Alcontentinbrain）、自發(fā)運動（locomotoractivity）、探索運動（exploratoryactivity）、學習記憶能力（learningandmemory）、神經遞質（neurotransmitters）、氧化應激（oxidativestress）、神經細胞計數(shù)（neuralcellscount）、超微結構（ultrastructuralstructure）、基因表達（geneexpression）。所有的行為測試都在上午9:00到下午5:00之間進行[45]，詳細實驗設計如圖1所示。圖1納米氧化鋁暴露斑馬魚胚胎后對成年斑馬魚各種指標檢測的實驗設計圖Figure1DiagramoftheexperimentaldesignusedtotestadultzebrafishaftertreatedzebrafishembryoswithAl2O3-NPs.

山西醫(yī)科大學碩士學位論文11間，每條斑馬魚都被單獨放置在T迷宮中測試。斑馬魚的行為由攝像機記錄，并由EthovisionXT10軟件分析。實驗測試包括3個階段：（1）斑馬魚對T迷宮進行為期4天的適應階段（habituation），以適應新環(huán)境。在適應階段，所有斑馬魚都被放入T迷宮中，但數(shù)量每天逐漸減少（16、8、4和1），直到每條魚被單獨放入T迷宮中并自由游動。（2）為期4天的訓練試驗（trainingtest）。訓練試驗旨在通過食物刺激，訓練斑馬魚出現(xiàn)在食物獎勵區(qū)，并給予食物獎勵，培養(yǎng)斑馬魚的聯(lián)想學習記憶能力[51]。在訓練試驗過程中，將每條魚放在T迷宮的起始區(qū)域，30秒后釋放，讓斑馬魚在T迷宮中探索4分鐘。潛伏期定義為斑馬魚從起始區(qū)域游到EC區(qū)所需的時間。在訓練期間，如果斑馬魚在4分鐘的測試時間內沒有出現(xiàn)在EC區(qū)，它將被引導到EC區(qū)，并允許它在其中停留1分鐘。訓練測試從每天早上9:00開始[45]，連續(xù)4天每天1次。（3）在最后一次訓練試驗的第2天進行記憶能力測試試驗，以評估記憶能力。在此階段，所有斑馬魚被單獨放入同一個T型迷宮中游動4分鐘，但不以食物作為獎勵。分析了斑馬魚在EC區(qū)的累計停留時間。具體實驗流程（如圖2）圖2T迷宮實驗箱及T迷宮實驗流程圖Figure2.T-mazeapparatusexperimenttankandflowchartofT-mazetest.

2.1 氧化鋁納米顆粒的表征 將納米氧化鋁懸濁液超聲 30 min 混勻，然后用透射電子顯微鏡檢測。通過圖像分析軟件分析納米氧化鋁顆粒懸濁液的透射電鏡結果，懸濁液中的納米氧化鋁顆粒顯示呈圓形，并沒有明顯的聚集，平均粒徑為（20.90±9.51）nm ，如圖3。采用納米粒度儀對納米氧化鋁懸濁液進行分析，結果表明：納米氧化鋁的平均水合粒徑為（86.89±10.87）nm，平均 Zeta 電位為（49.43±2.21）mv。
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本文編號：2889279