目的本研究以生地炭“制炭存性”差異為切入點(diǎn),提出“地黃炭止血‘存性’的物質(zhì)基礎(chǔ),不僅包括體外轉(zhuǎn)化物,還包括體內(nèi)代謝物;而這些物質(zhì)基礎(chǔ)的量變與質(zhì)變一定程度上主要取決于制炭工藝”的工作假說(shuō)。通過(guò)采用代謝組學(xué)技術(shù),結(jié)合熱分析技術(shù),對(duì)生地黃(炒炭、煅炭)的工藝參數(shù)進(jìn)行量化表征;對(duì)生地炭在體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程和代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行比較分析,進(jìn)而闡明生地黃制炭(炒炭、煅炭)工藝與其止血“存性”之間的相關(guān)性,構(gòu)建基于熱分析-代謝組學(xué)技術(shù)的中藥炮制工藝與炮制機(jī)制研究的新模式。方法1.建立生地黃及其兩種制炭品(炒炭、煅炭)10批樣品HPLC指紋圖譜。色譜條件:采用Hypersil GOLD aq C_(18)色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水,梯度洗脫,體積流量為1 mL·min~(-1),柱溫為30℃,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。對(duì)結(jié)果進(jìn)行主成分分析、聚類(lèi)分析和相似度評(píng)價(jià)。2.生地黃制炭前后血中有效成分群的初步確定:分別制備生地黃及其制炭品的水提物樣品,將各提取物給大鼠連續(xù)灌胃3天,取血,制備大鼠含藥血清。采用HPLC指紋圖譜方法對(duì)大鼠的含藥血清進(jìn)行檢測(cè),確定血中移行成分。結(jié)合生地黃制炭前后體外化學(xué)成分組研究結(jié)果,綜合分析,初步確定生地炭可能的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。3.采用熱重分析技術(shù),以生地黃為試樣,在程序升溫條件下,通過(guò)變換熱分析氣氛,即分別以空氣、氮?dú)鈿夥?模擬傳統(tǒng)制炭品制備過(guò)程;同時(shí),在相同實(shí)驗(yàn)條件下,以地黃藥效物質(zhì)群進(jìn)行熱重分析實(shí)驗(yàn);最終,以藥效物質(zhì)群最大熱失重速率所對(duì)應(yīng)的溫度作為生地黃制炭工藝參數(shù)(火力、火候)量化指標(biāo)。4.通過(guò)皮下注射20%干酵母聯(lián)合無(wú)水乙醇灌胃的方法建立血熱出血模型,基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái),通過(guò)對(duì)血清中小分子代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)分析,尋找兩種制炭方式(炒炭、煅炭)的差異代謝物和代謝途徑。結(jié)果1.10批生地黃樣品共指認(rèn)出15個(gè)色譜峰,炒炭品共指認(rèn)出11個(gè)色譜峰,煅炭品共指認(rèn)出8個(gè)色譜峰。且生地黃和兩種制炭品在主成分分析和聚類(lèi)分析中均能達(dá)到顯著分離,相似度評(píng)價(jià)揭示了產(chǎn)地對(duì)樣品的差異化影響。2.性別對(duì)地黃及其制炭品入血藥效成分沒(méi)有顯著影響。生地黃兩種制炭法(炒炭和煅炭)之間入血成分類(lèi)似,但是具體含量有差別,究竟由制炭方式引起還是由其他因素導(dǎo)致的仍然需要進(jìn)一步考察。另外生地黃制炭前后,研究認(rèn)為梓醇以原形進(jìn)入到血液中,是地黃的生物藥效指標(biāo)。3.地黃炒炭的最佳溫度應(yīng)控制在果糖、梓醇熱解之前,為5-HMF熱解最大熱失重速率峰時(shí)的溫度,即216.3℃為地黃炒炭最佳溫度,梓醇的最大熱失重速率峰峰溫274.3℃為炒炭溫度上限。4.生地黃煅炭的最佳溫度應(yīng)控制在果糖、梓醇熱解之前,為5-HMF熱解最大熱失重速率峰時(shí)的溫度,即194.2℃為地黃煅炭最佳溫度,梓醇的最大熱失重速率峰峰溫276.8℃為煅炭溫度上限。5.基于血熱出血模型和UPLC-MS代謝組學(xué)技術(shù)平臺(tái)的生地黃不同制炭方式(炒炭、煅炭)的差異代謝物和代謝途徑研究。(1)通過(guò)皮下注射20%干酵母聯(lián)合無(wú)水乙醇灌胃的方法建立血熱出血模型。模型大鼠肺、胃組織肉眼可見(jiàn)多個(gè)出血點(diǎn),肝腎顏色加深,肺組織病理檢查表現(xiàn)為間質(zhì)出血、炎性細(xì)胞浸潤(rùn),肛溫在8h內(nèi)顯著升高(P0.05),TT和PT顯著延長(zhǎng)(P0.05),血漿FIB含量顯著增加(P0.05),說(shuō)明血熱出血模型大鼠凝血功能異常,有明顯的出血傾向。此外,陽(yáng)性藥組、生地黃組、炒炭組(傳統(tǒng)和新法)、煅炭組(傳統(tǒng)和新法)均可顯著的降低不同凝血因子的相對(duì)含量(P0.05),表明生地黃制炭(炒炭、煅炭)后止血作用增強(qiáng),止血作用在生地黃炒炭品和煅炭品之間具備一定的差異性。本研究結(jié)果也表明生地黃、生地黃炒炭品和生地黃煅炭品通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體內(nèi)源性凝血系統(tǒng)的功能發(fā)揮止血作用。(2)模型大鼠不僅存在凝血功能異常,還呈現(xiàn)血液流變學(xué)異常。具體表現(xiàn)為全血高中低切黏度、血漿黏度、全血高、低切還原黏度,紅細(xì)胞剛性指數(shù),紅細(xì)胞聚集指數(shù)等均顯著升高(P0.05)。分析認(rèn)為,生地黃炒炭品可顯著改善相關(guān)血液流變學(xué)指標(biāo)(P0.05),表明生地黃炒炭后依然保留其“涼血”作用。而生地黃煅炭品僅在全血高切和低切還原粘度有顯著的降低作用(P0.05),對(duì)其他血液流變學(xué)指標(biāo)未有顯著影響。其余各組的上述相關(guān)指數(shù)在一定程度上也得到改善。(3)不同火力、火候的炮制方式對(duì)其炮制品的藥效具備顯著差異性影響(P0.05)。新法炒炭、煅炭品與傳統(tǒng)制法從止血涼血的藥效研究來(lái)看仍然具備一定差異,但是其仍保留了地黃炭涼血止血的療效。另一方面炮制太過(guò)和炮制不及的地黃制炭品在涼血止血方面療效不顯著,進(jìn)一步印證了中藥傳統(tǒng)炮制理論有關(guān)“凡藥制造,貴在適中,不及則功效難求,太過(guò)則氣味反失”的論述。(4)通過(guò)基于血熱出血模型大鼠血清代謝組學(xué)的研究,表明不同炮制方式對(duì)炮制品內(nèi)源性代謝輪廓具備顯著的影響,具體表現(xiàn)為:1)生地黃炒炭和煅炭的炮制方式具備一定的差異性。2)新法炒、煅炭和傳統(tǒng)炒、煅炭炮制品之間具備差異性。3)炮制太過(guò)和炮制不及對(duì)其內(nèi)源性產(chǎn)物之間具備差異性。但是,綜合分析認(rèn)為,無(wú)論何種炮制方式,仍然有向空白組回調(diào)的趨勢(shì),表明地黃制炭后均有不同程度“存性”。(5)基于非靶標(biāo)代謝組學(xué)平臺(tái),篩選了傳統(tǒng)炒炭和傳統(tǒng)煅炭?jī)煞N炮制方式之間的42個(gè)差異性代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步分析了其可能參與的17條代謝通路、內(nèi)源性小分子在各組之間的含量差異和其調(diào)節(jié)趨勢(shì),探究了其發(fā)揮療效的生物學(xué)機(jī)制。結(jié)論本研究通過(guò)指紋圖譜和血清藥物分析鑒定了生地黃兩種制炭方式(炒炭、煅炭)的體外藥效學(xué)物質(zhì)。采用代謝組學(xué)技術(shù),結(jié)合熱分析技術(shù),對(duì)生地黃(炒炭、煅炭)的工藝參數(shù)進(jìn)行了量化表征;同時(shí)對(duì)生地炭在體內(nèi)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程和代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行比較分析,認(rèn)為生地黃炒炭品具有“涼血止血”作用,生地黃煅炭品僅保留“止血”作用,而無(wú)顯著的“涼血”作用。中藥炮制過(guò)程中火力、火候?qū)ε谥破返乃幮镔|(zhì)和代謝輪廓影響顯著。同時(shí)篩選得到生地黃制炭(炒炭、煅炭)的42個(gè)差異性代謝產(chǎn)物,進(jìn)一步分析了其可能參與的17條代謝通路和內(nèi)源性小分子在各組之間的含量差異、調(diào)節(jié)趨勢(shì),闡明了生地黃制炭(炒炭、煅炭)工藝與其止血“存性”之間的相關(guān)性。
【學(xué)位單位】：山西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類(lèi)】：R283
【部分圖文】：
生地黃炭止血“存性”與制炭工藝相關(guān)性研究9項(xiàng)色譜條件下，記錄高效液相色譜圖，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度，結(jié)果相似度大于0.97，表明該方法重復(fù)性良好。2.4指紋圖譜建立分別取10批生地黃和生地黃炒炭、生地黃煅炭樣品，按“2.2”制備方法炮制并且按照“2.1”方法測(cè)定，記錄高效液相色譜圖，運(yùn)用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008A版”對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2-6和表2。圖2混合對(duì)照品HPLC色譜圖注：1.梓醇；2.5-HMF；3.地黃苷D；4.益母草苷；5.毛蕊花糖苷?qǐng)D310批不同產(chǎn)地生地黃指紋圖譜
生地黃炭止血“存性”與制炭工藝相關(guān)性研究9項(xiàng)色譜條件下，記錄高效液相色譜圖，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算相似度，結(jié)果相似度大于0.97，表明該方法重復(fù)性良好。2.4指紋圖譜建立分別取10批生地黃和生地黃炒炭、生地黃煅炭樣品，按“2.2”制備方法炮制并且按照“2.1”方法測(cè)定，記錄高效液相色譜圖，運(yùn)用中國(guó)藥典委員會(huì)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008A版”對(duì)所得指紋圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖2-6和表2。圖2混合對(duì)照品HPLC色譜圖注：1.梓醇；2.5-HMF；3.地黃苷D；4.益母草苷；5.毛蕊花糖苷?qǐng)D310批不同產(chǎn)地生地黃指紋圖譜
10批不同產(chǎn)地生地黃炒炭指紋圖譜
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本文編號(hào)：
2888060
