Ihh信號(hào)通路在咬合升高致TMJOA髁突軟骨中的表達(dá)變化及作用機(jī)制研究
【學(xué)位單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R782.6
【部分圖文】：
山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文8第二步——口內(nèi)手術(shù)：牙齒表面經(jīng)過清潔處理后，將標(biāo)準(zhǔn)尺寸的鋁片置于口腔的上頜后牙列。將3M流動(dòng)樹脂注入鋁片圍墻中，光固化以形成咬合墊。以形成上頜后牙的第一磨牙的咬合墊高度為1.5mm、第三磨牙的咬合墊高度為1mm的楔形咬合升高模型。第三步——修整邊緣：切下鋁板的多余部分，并使用特殊的正畸藍(lán)膠封閉銳利的邊緣（圖1A）。圖1A“三明治”咬合升高的具體步驟（3）動(dòng)物處置咬合升高后的第3、7、14和28天，進(jìn)行腹主動(dòng)脈采血，離心后得到血清。隨后用過量的水合氯醛殺死大鼠。取出大鼠的雙側(cè)髁突組織，將左側(cè)髁突組織固定于多聚甲醛中，進(jìn)行切片制作；將右側(cè)髁突組織暫時(shí)保存在-80℃液氮中，隨后進(jìn)行基因檢測(cè)。1.2.2大鼠血清Ihh的ELISA檢測(cè)（1）六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的配制：按照實(shí)驗(yàn)說(shuō)明書的步驟對(duì)試劑盒內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋，隨后開始配置六個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品。（2）進(jìn)行孔板設(shè)置及加樣：分別設(shè)置三種孔板：標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白樣品孔及待測(cè)樣品孔。待測(cè)樣品孔的加樣方法是每孔先加入40ul的樣品稀釋液，再加10ul的待測(cè)樣品；標(biāo)準(zhǔn)品孔則需在酶標(biāo)板內(nèi)準(zhǔn)確加樣配置好的各種標(biāo)準(zhǔn)品，每孔50ul；空白樣品孔中除了不加酶標(biāo)試劑及待測(cè)樣品以外，其余每步的操作步驟與其他兩種孔板相同。（3）加酶：各孔加入100ul的酶試劑。（4）溫育：使用封板膜進(jìn)行小心地封板，將鋪板置于37℃的恒溫水浴箱內(nèi)，開始計(jì)時(shí)30分鐘的溫育。（5）洗滌：小心地揭掉封板膜，垂直倒向地棄去孔板內(nèi)的液體并拍干殘液，隨
山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文15運(yùn)用單因素方差分析對(duì)組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，將實(shí)驗(yàn)組咬合升高第三天與咬合升高第七天相比，以及實(shí)驗(yàn)組咬合升高第三天與咬合升高第十四天相比，發(fā)現(xiàn)各組間血清Ihh濃度的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而且，實(shí)驗(yàn)組咬合升高第七天血清內(nèi)Ihh濃度與咬合升高第二十八天相比，以及實(shí)驗(yàn)組咬合升高第十四天血清內(nèi)Ihh濃度與咬合升高第二十八天相比，差異都是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的意義（P<0.05）（表3）。表3Elisa檢測(cè)出各組別血清中的Ihh濃度組別Ihh的血清濃度（ng/ml）n對(duì)照組第三天0.18±0.026實(shí)驗(yàn)組第三天0.19±0.01**#6對(duì)照組第七天0.19±0.026實(shí)驗(yàn)組第七天0.23±0.02****6對(duì)照組第十四天0.21±0.036實(shí)驗(yàn)組第十四天0.22±0.03***6對(duì)照組第二十八天0.18±0.026實(shí)驗(yàn)組第二十八天0.19±0.016總計(jì)48*:與對(duì)照組比較,P<0.05**:與實(shí)驗(yàn)組第七天比較,P<0.05#:與實(shí)驗(yàn)組第十四天比較,P<0.05***:與實(shí)驗(yàn)組第二十八天比較,P<0.05圖2ELISA檢測(cè)各組別血清內(nèi)Ihh的濃度（ng/ml）
山西醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文16*:與對(duì)照組比較,P<0.05**:與實(shí)驗(yàn)組第七天比較,P<0.05#:與實(shí)驗(yàn)組第十四天比較,P<0.05***:與實(shí)驗(yàn)組第二十八天比較,P<0.052.3實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠TMJ髁突軟骨的形態(tài)學(xué)比較形態(tài)學(xué)染色表明，實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨變性的嚴(yán)重程度與咬合升高發(fā)生的時(shí)間密切相關(guān)。但是在不同時(shí)間段的HE或番紅O固綠染色中，對(duì)照組間的組織學(xué)切片均沒有發(fā)現(xiàn)可檢測(cè)到的差異，故我們隨機(jī)選擇對(duì)照組第三天、七天、十四天或第二十八天的一張切片進(jìn)行圖像采集。2.3.1實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠TMJ髁突軟骨的HE染色比較HE染色結(jié)果顯示，大鼠的髁突軟骨由外向內(nèi)依次可分為纖維層，增殖層，肥大層和軟骨內(nèi)骨化層。咬合升高三天的實(shí)驗(yàn)組切片顯示出軟骨細(xì)胞的簇集現(xiàn)象。之后，實(shí)驗(yàn)組的軟骨層結(jié)構(gòu)更加紊亂，細(xì)胞萎縮，細(xì)胞核被密集染色。增殖層中的軟骨細(xì)胞出現(xiàn)排列紊亂，甚至一些細(xì)胞的核仁呈現(xiàn)完全消失。此外，軟骨空腔增加，留下空白陰影，提示出現(xiàn)早期的骨關(guān)節(jié)炎軟骨病變（圖3）。圖3咬合升高后不同時(shí)間段的髁突軟骨HE染色A，B，C，D和E分別代表對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組第3天、實(shí)驗(yàn)組第7天、實(shí)驗(yàn)組第14天和實(shí)驗(yàn)組第28天髁突軟骨的HE染色圖像（×100）2.3.2實(shí)驗(yàn)組大鼠與對(duì)照組大鼠TMJ髁突軟骨的番紅O固綠染色比較番紅O固綠染色表明，早期實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨的染色較深，中晚期顏色變淺。咬合升高第三天，實(shí)驗(yàn)組髁突軟骨的肥大層內(nèi)出現(xiàn)了軟骨細(xì)胞的聚集。在第七天實(shí)驗(yàn)組
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