發(fā)布時間：2020-10-29 14:36

　　 IgA腎病是青壯年腎功能不全的重要病因,占我國原發(fā)性腎小球腎炎的20%~45.26%,該病是一組臨床表現(xiàn)主要為血尿,可伴有高血壓、蛋白尿和腎功能受損等的一種疾病�，F(xiàn)已有學(xué)者提出“多重打擊機制”等發(fā)病學(xué)說,但造成該病腎臟損傷的機制尚未完全闡明,且并未出現(xiàn)治療該病的特異性方法。目前,糖皮質(zhì)激素等免疫抑制劑雖然取得一定臨床療效,但其副作用較大,臨床使用受限,而中醫(yī)治療該病在近幾年取得了一定的成果,我科的前期實驗證明了防己黃芪湯的有效成分漢防己甲素能在一定濃度下有效抑制健康志愿者外周血淋巴細(xì)體內(nèi)胞的增殖并協(xié)同增強糖皮質(zhì)激素的免疫能力,且防己黃芪湯在治療IgA腎病的臨床效果較好,能有效改善患者血尿、蛋白尿等臨床癥狀,并延緩疾病進展,故本文選用優(yōu)化后的院內(nèi)制劑防己黃芪顆粒進行實驗。目的:研究防己黃芪顆粒含藥血清對IgA腎病患者外周血單個核細(xì)胞中CD4~+T/CD8~+T比值和CD4~+CD25~+T細(xì)胞亞群的影響,從而探討防己黃芪顆粒治療IgA腎病的作用機制。方法:1)含藥血清制備:選取志愿者10名,5女5男,年齡20~35歲。干預(yù)之前,晨起空腹抽取肱靜脈血20ml,離心并處理血清,為空白對照組,隨后志愿者開始服用防己黃芪湯顆粒劑,連續(xù)服用6天,處理分離血清,第6天早晨空腹抽取肱靜脈血20ml并處理分離血清,用作含藥血清。2)人外周單個核細(xì)胞(PBMC)的提取:從我科的慢性腎臟病隊列研究中收集10例CKD2~3期的IgA腎病患者,5男5女,每人收集15ml新鮮全血通過密度梯度離心法分離外周血單個核細(xì)胞。3)運用CCK-8法檢測健康人空白血清與10%胎牛血清作用的等效性,確定后續(xù)試驗培養(yǎng)外周單個核細(xì)胞的含藥血清干預(yù)濃度。4)細(xì)胞分組及干預(yù):將分離的正常人和IgA腎病患者的PBMC分為模型組、正常組、治療組、對照組并進行相應(yīng)干預(yù),干預(yù)后培養(yǎng)48h,隨后檢測相應(yīng)指標(biāo)。5)培養(yǎng)48h后通過流式細(xì)胞儀檢各組淋巴細(xì)胞亞群。結(jié)果:1)通過CCK-8法測定選取10%濃度的空白血清以及含藥血清作為后續(xù)試驗的干預(yù)濃度,10%的人空白血清對人外周單個核細(xì)胞的細(xì)胞增值率與10%FBS相比,并無統(tǒng)計學(xué)差異。(P0.05)2)與正常人組相比,IgAN患者組的CD4~+T/CD8~+T的比值并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)3)與正常人組相比,IgAN患者組的CD4~+TCD25~+T的比值有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)4)防己黃芪顆粒含藥血清調(diào)節(jié)前后的正常人CD4~+T/CD8~+T的比值并無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)5)防己黃芪顆粒含藥血清調(diào)節(jié)前后的IgAN的CD4~+CD25~+T的比值具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)結(jié)論:用10%防己黃芪顆粒含藥血清進行干預(yù),研究發(fā)現(xiàn),正常人組與IgAN患者組相比,CD4~+T/CD8~+T的比值并無統(tǒng)計學(xué)差異,證實對于CKD2~3期的患者而言,CD4~+T/CD8~+T比值分布的差異并不顯著,并不能作為IgAN早期生物診斷標(biāo)準(zhǔn);與正常人相比,IgAN患者的CD4~+TCD25~+T淋巴細(xì)胞顯著低于對照組(P0.05),提示CD4~+CD25~+T淋巴細(xì)胞分布與IgAN腎病相關(guān),表明IgAN患者存在免疫失調(diào),表現(xiàn)為Treg的下降。本研究同樣證實防己黃芪顆粒含藥血清可以有效上調(diào)該病患者的CD4~+TCD25~+T淋巴細(xì)胞,具有免疫調(diào)節(jié)功能,延緩疾病進展。
【學(xué)位單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2020
【中圖分類】：R277.5
【部分圖文】：

防己黃芪顆粒含藥血清對IgA腎病患者外周血單個核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群的有影響79)計數(shù)：根據(jù)實驗不同需要進行計數(shù),用細(xì)胞計數(shù)儀記錄細(xì)胞的增殖情況。加樣槍充分混勻每個樣本后計數(shù),吸取少量細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),每樣品濃度四次計數(shù)的平均值。記錄細(xì)胞濃度與培養(yǎng)液體積的乘積作為當(dāng)次統(tǒng)計時淋巴細(xì)胞的總量。計算細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)細(xì)胞初始濃度至1×105,取1ml轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)皿,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。2.4.1.CCK-8法確定健康志愿者血清的加入濃度1)將前面新鮮分離備用的PBMC懸液取出，并用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打調(diào)整為1×105個/ml密度的細(xì)胞懸液。2)在96孔板中配置100μl（大約含有10000個細(xì)胞）的淋巴細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37°C、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%后吸棄舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)板加同濃度的空白血清和conA（具體濃度見下表）。3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24小時。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2-5小時。6)用酶標(biāo)儀測定在420nm處的吸光度。圖1密度梯度離心法示意圖圖2密度梯度離心法實圖

防己黃芪顆粒含藥血清對IgA腎病患者外周血單個核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群的有影響79)計數(shù)：根據(jù)實驗不同需要進行計數(shù),用細(xì)胞計數(shù)儀記錄細(xì)胞的增殖情況。加樣槍充分混勻每個樣本后計數(shù),吸取少量細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),每樣品濃度四次計數(shù)的平均值。記錄細(xì)胞濃度與培養(yǎng)液體積的乘積作為當(dāng)次統(tǒng)計時淋巴細(xì)胞的總量。計算細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)細(xì)胞初始濃度至1×105,取1ml轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)皿,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。2.4.1.CCK-8法確定健康志愿者血清的加入濃度1)將前面新鮮分離備用的PBMC懸液取出，并用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打調(diào)整為1×105個/ml密度的細(xì)胞懸液。2)在96孔板中配置100μl（大約含有10000個細(xì)胞）的淋巴細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37°C、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%后吸棄舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)板加同濃度的空白血清和conA（具體濃度見下表）。3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24小時。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2-5小時。6)用酶標(biāo)儀測定在420nm處的吸光度。圖1密度梯度離心法示意圖圖2密度梯度離心法實圖

防己黃芪顆粒含藥血清對IgA腎病患者外周血單個核細(xì)胞中淋巴細(xì)胞亞群的有影響79)計數(shù)：根據(jù)實驗不同需要進行計數(shù),用細(xì)胞計數(shù)儀記錄細(xì)胞的增殖情況。加樣槍充分混勻每個樣本后計數(shù),吸取少量細(xì)胞懸液于血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),每樣品濃度四次計數(shù)的平均值。記錄細(xì)胞濃度與培養(yǎng)液體積的乘積作為當(dāng)次統(tǒng)計時淋巴細(xì)胞的總量。計算細(xì)胞活力，調(diào)節(jié)細(xì)胞初始濃度至1×105,取1ml轉(zhuǎn)入完全培養(yǎng)皿,于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),條件為37℃、5%CO2、飽和濕度。2.4.1.CCK-8法確定健康志愿者血清的加入濃度1)將前面新鮮分離備用的PBMC懸液取出，并用RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞吹打調(diào)整為1×105個/ml密度的細(xì)胞懸液。2)在96孔板中配置100μl（大約含有10000個細(xì)胞）的淋巴細(xì)胞懸液。將培養(yǎng)板置于37°C、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時（37℃，5%CO2）。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%后吸棄舊培養(yǎng)液，向培養(yǎng)板加同濃度的空白血清和conA（具體濃度見下表）。3)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24小時。4)向每孔加入10μlCCK8溶液。5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2-5小時。6)用酶標(biāo)儀測定在420nm處的吸光度。圖1密度梯度離心法示意圖圖2密度梯度離心法實圖
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2861039