本文關(guān)鍵詞：HMGB1修飾納米纖維支架對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化和骨修復(fù)的影響，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨是高度血管化的組織,血管新生在骨發(fā)育和骨缺損的修復(fù)中起重要的作用,大段骨缺損修復(fù)仍然是骨科中一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的課題。目前,臨床治療大段骨缺損的主要方法是自體移植和/或異體移植,而這兩種方法都無(wú)法誘導(dǎo)血管新生,并存在著來(lái)源不足、供體部位損傷、潛在的疾病可能性或排斥反應(yīng)等缺陷。骨組織工程支架雖然能夠避免這些缺陷,但這些支架在應(yīng)用中往往同樣缺乏足夠血管新生和血液供給,易導(dǎo)致氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給不足甚至細(xì)胞死亡,影響修復(fù)效果甚至導(dǎo)致修復(fù)失敗。支架移植入骨組織后,炎癥反應(yīng)會(huì)引起由周?chē)M織向材料內(nèi)部的血管生長(zhǎng)和干細(xì)胞誘導(dǎo)的血管新生。在細(xì)胞損傷后,促炎癥因子高遷移率族蛋白B 1(High-mobility group box 1,HMGB 1)作為組織損傷的第一批信號(hào)之一從壞死細(xì)胞中被動(dòng)釋放,參與炎癥反應(yīng)、組織損傷和再生的過(guò)程。HMGB 1能作為一種多功能信號(hào)因子引起細(xì)胞響應(yīng),包括促進(jìn)多種干細(xì)胞遷移、促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)向成骨方向分化等,因此推測(cè)HMGB 1有骨誘導(dǎo)能力。HMGB 1還能夠促進(jìn)心肌和血管生成干/祖細(xì)胞(Cardiac and angiogenic stem/progenitor cells)的分化,因此HMGB 1也可能是強(qiáng)促血管新生因子。本研究擬利用HMGB 1制備同時(shí)具有骨誘導(dǎo)能力和促血管新生能力的骨組織工程支架,以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)。將HMGB 1作為信號(hào)分子通過(guò)肝素修飾在靜電紡絲納米纖維支架上,制備成生物活性納米纖維骨組織工程支架,并研究其對(duì)成骨分化和血管新生的影響,以及對(duì)骨缺損修復(fù)的影響。本文主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)論如下:①原代大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)和鑒定。提取的原代大鼠MSCs具有成纖維樣細(xì)胞形態(tài)、粘附能力和增殖潛力較強(qiáng)。三向分化實(shí)驗(yàn)證明MSCs能夠向骨、軟骨和脂肪細(xì)胞分化。②制備和表征HMGB 1修飾骨組織工程支架。成功制備了具有良好多孔結(jié)構(gòu)、內(nèi)部連通、力學(xué)性能且能夠模擬細(xì)胞外基質(zhì)的納米纖維支架。成功利用肝素分子修飾HMGB 1至納米纖維表面。HMGB 1在支架上分布均勻,釋放緩慢。③體外研究HMGB 1修飾骨組織工程支架對(duì)MSCs影響。體外實(shí)驗(yàn)表明HMGB 1修飾骨組織工程支架在7天時(shí)對(duì)MSCs增殖沒(méi)有影響;在14天時(shí)對(duì)MSCs存活沒(méi)有影響,沒(méi)有細(xì)胞毒性;能夠促進(jìn)MSCs的粘附;使MSCs形態(tài)更細(xì)長(zhǎng)并呈各向異性分布;可誘導(dǎo)MSCs向成骨方向分化。④利用大鼠皮下埋植模型考察HMGB 1修飾骨組織工程支架對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)、成骨修修復(fù)和血管新生的影響。HE實(shí)驗(yàn)表明HMGB 1修飾骨組織工程支架支架有細(xì)胞浸潤(rùn),生物相容性良好。CD31與CD34染色表明支架能夠促進(jìn)血管新生;對(duì)骨鈣素(Osteocalcin,OCN)進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)支架能夠促進(jìn)成骨分化。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)HMGB 1修飾骨組織工程支架能夠通過(guò)上調(diào)間質(zhì)細(xì)胞來(lái)源的因子1(Stromal cell-derived factor 1,SDF 1)的表達(dá)招募MSCs向支架內(nèi)部遷移。CD68染色發(fā)現(xiàn)該支架并沒(méi)有引起額外的炎癥反應(yīng),安全性好。⑤利用大鼠顱骨缺損模型研究HMGB 1修飾骨組織工程支架對(duì)大塊骨缺損修復(fù)的影響以及成骨分化和微血管新生的情況。HE染色證明HMGB 1修飾骨組織工程支架能夠顯著促進(jìn)骨缺損的修復(fù)質(zhì)量和修復(fù)速度。CD34免疫熒光染色和OCN免疫組化證明,HMGB 1修飾骨組織工程支架在骨環(huán)境中有促成骨分化和血管新生能力。綜上所述,本研究利用HMGB 1作為組織工程信號(hào)分子,成功制備了一種骨組織工程支架,可同時(shí)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管新生、誘導(dǎo)成骨分化、招募干細(xì)胞,以提升骨缺損的修復(fù)效果。
【關(guān)鍵詞】：骨組織工程 高遷移率族蛋白B1 血管新生 骨修復(fù) 間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 摘要3-5
• 英文摘要5-12
• 1 緒論12-20
• 1.1 問(wèn)題的提出及研究意義12-17
• 1.1.1 問(wèn)題的提出12-17
• 1.1.2 研究意義17
• 1.2 本文研究目的和研究?jī)?nèi)容17-20
• 1.2.1 本文研究目的17-18
• 1.2.2 本文研究的主要內(nèi)容18
• 1.2.3 本文研究的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)18-20
• 2 MSCS分離、培養(yǎng)和多向分化潛能的鑒定20-30
• 2.1 引言20-22
• 2.2 材料與試劑22-23
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物22
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材22
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑22-23
• 2.2.4 主要試劑的配制23
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 2.3.1 全骨髓貼壁法分離提取原代大鼠骨髓MSCs23-24
• 2.3.2 MSCs的培養(yǎng)、純化和傳代24
• 2.3.3 MSCs多向分化潛能的鑒定24-25
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-27
• 2.4.1 MSCs分離和培養(yǎng)25-26
• 2.4.2 MSCs多向分化潛能的鑒定26-27
• 2.5 討論與分析27-28
• 2.6 本章小結(jié)28-30
• 3 制備和表征HMGB 1 修飾PLLA/PCL納米纖維骨組織工程支架30-42
• 3.1 引言30-32
• 3.2 材料與試劑32-33
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器與耗材32-33
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑33
• 3.2.3 主要試劑的配制33
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法33-35
• 3.3.1 靜電紡絲納米纖維薄膜的制備33-34
• 3.3.2 掃描電子顯微鏡(Scanning electron microscopy, SEM)表征34
• 3.3.3 納米纖維薄膜的力學(xué)性能測(cè)試34
• 3.3.4 HMGB 1 修飾納米纖維支架的制備34-35
• 3.3.5 HMGB 1 修飾納米纖維支架的表征35
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-39
• 3.4.1 靜電紡絲納米纖維薄膜的制備35
• 3.4.2 SEM表征結(jié)果35-36
• 3.4.3 納米纖維薄膜的力學(xué)性能測(cè)試36-37
• 3.4.4 HMGB 1 修飾納米纖維支架的制備和表征37-39
• 3.5 討論與分析39
• 3.6 本章小結(jié)39-42
• 4 體外研究HMGB 1 修飾骨組織工程支架對(duì)MSCS的影響42-60
• 4.1 引言42
• 4.2 材料與試劑42-43
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材42
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑42-43
• 4.2.3 主要試劑的配制43
• 4.3 實(shí)驗(yàn)方法43-47
• 4.3.1 實(shí)驗(yàn)分組43
• 4.3.2 MTS測(cè)量細(xì)胞增殖43
• 4.3.3 Calcein AM/PI檢測(cè)細(xì)胞存活43-44
• 4.3.4 MSCs粘附和細(xì)胞形態(tài)44-45
• 4.3.5 實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)不同支架對(duì)MSCs分化的影響45-46
• 4.3.6 不同支架對(duì)MSCs的堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)表達(dá)的影響46
• 4.3.7 茜素紅S染色檢測(cè)不同支架對(duì)MSCs鈣結(jié)節(jié)的影響46-47
• 4.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-58
• 4.4.1 MTS測(cè)量細(xì)胞增殖47-48
• 4.4.2 Calcein AM/PI檢測(cè)細(xì)胞存活48-50
• 4.4.3 MSCs粘附和細(xì)胞形態(tài)50
• 4.4.4 實(shí)時(shí)定量PCR (qRT-PCR)檢測(cè)不同支架對(duì)MSCs分化的影響50-51
• 4.4.5 不同支架對(duì)MSCs的ALP表達(dá)的影響51-54
• 4.4.6 不同支架對(duì)MSCs鈣結(jié)節(jié)的影響54-58
• 4.5 討討論與分析58-59
• 4.6 本章小結(jié)59-60
• 5 HMGB 1 修飾骨組織工程支架對(duì)成骨分化和血管新生的影響60-78
• 5.1 引言60
• 5.2 材料與試劑60-61
• 5.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60
• 5.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材60
• 5.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑60-61
• 5.2.4 主要試劑的配制61
• 5.3 實(shí)驗(yàn)方法61-63
• 5.3.1 皮下埋植實(shí)驗(yàn)材料61
• 5.3.2 皮下埋植實(shí)驗(yàn)61
• 5.3.3 石蠟切片61-62
• 5.3.4 冰凍切片62
• 5.3.5 免疫熒光染色62
• 5.3.6 HE染色62
• 5.3.7 免疫組織化學(xué)染色62-63
• 5.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果63-75
• 5.4.1 一般觀察63
• 5.4.2 HE染色結(jié)果63-64
• 5.4.3 不同支架材料在體促成骨分化能力研究64-66
• 5.4.4 在體研究不同支架材料對(duì)微血管血管新生的影響研究66-69
• 5.4.5 在體研究不同支架材料對(duì)MSCs的招募作用69-72
• 5.4.6 在體研究不同支架材料對(duì)MSCs的招募作用的原理72-74
• 5.4.7 不同支架材料在皮下的炎癥響應(yīng)情況74-75
• 5.5 討論與分析75-76
• 5.6 本章小結(jié)76-78
• 6 HMGB 1 修飾骨組織工程支架在大鼠顱骨缺損模型中的修復(fù)效果78-88
• 6.1 引言78
• 6.2 材料與試劑78-79
• 6.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物78
• 6.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器及耗材78
• 6.2.3 實(shí)驗(yàn)試劑78-79
• 6.2.4 主要試劑的配制79
• 6.3 實(shí)驗(yàn)方法79
• 6.3.1 顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)材料79
• 6.3.2 大鼠顱骨缺損修復(fù)實(shí)驗(yàn)79
• 6.3.3 切片、HE染色、免疫熒光以及免疫組織化學(xué)79
• 6.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果79-85
• 6.4.1 HE染色79-81
• 6.4.2 OCN免疫組織化學(xué)染色81-82
• 6.4.3 CD34免疫熒光染色82-85
• 6.5 討論與分析85
• 6.6 本章小結(jié)85-88
• 7 結(jié)論與展望88-90
• 7.1 本文主要結(jié)論88-89
• 7.2 后續(xù)研究工作展望89-90
• 致謝90-92
• 參考文獻(xiàn)92-100
• 附錄100
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文目錄100
• B. 作者在攻讀學(xué)位期間取得的科研成果目錄100

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1 賈駿;段Z腪，

本文編號(hào)：285574