發(fā)布時(shí)間：2019-09-23 20:07

【摘要】：目的:急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(acute gouty arthritis,AGA)是尿酸鹽晶體沉積于關(guān)節(jié)及其周?chē)M織引起的一種急性炎癥性風(fēng)濕病。尿酸鈉晶體(Monosodium urate,MSU)經(jīng)常駐巨噬細(xì)胞識(shí)別、吞噬,通過(guò)My D88依賴性信號(hào)傳導(dǎo)途徑激活NF-κB,同時(shí)NLRP3炎性體經(jīng)多種途徑刺激后合成并被激活,最終釋放大量IL-1β、TNF-α、IL-8等炎性因子,引起關(guān)節(jié)腫脹和劇烈疼痛。目前,AGA的常用治療藥物主要有秋水仙堿、糖皮質(zhì)激素、非甾體類抗炎藥及IL-1抑制劑等,但這些藥物臨床療效不足,且毒副作用較大或價(jià)格昂貴,臨床應(yīng)用受到一定限制,亟待發(fā)掘更加安全有效的藥物。中醫(yī)學(xué)對(duì)痛風(fēng)的認(rèn)識(shí)歷史悠久。近年來(lái),從傳統(tǒng)中醫(yī)藥中發(fā)掘安全有效抗急性痛風(fēng)藥物的研究日益受到重視。本實(shí)驗(yàn)在既往研究的基礎(chǔ)上,通過(guò)建立尿酸鈉晶體誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型,觀察中藥有效成分青藤堿(Sinomenine,SIN)、白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子、My D88-NF-κB和NLRP3炎性體信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的影響,探討中藥有效成分青藤堿、白芍總苷及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)AGA的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。方法:1建立MSU晶體誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型采用痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵炎性因子IL-1β表達(dá)值作為細(xì)胞造模成功的參考指標(biāo)。分別用0、10、50、100、200、400、600、1000mg/L尿酸鈉晶體混懸液刺激RAW264.7細(xì)胞,在3、6、12、24、48h取培養(yǎng)上清,用ELISA法檢測(cè)IL-1β表達(dá)水平。2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞密度為5×104/m L,每孔200?l,置于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜后更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,分別設(shè)正常組(Control)(DMEM)、模型組(Model)(DMEM+終濃度50mg/L MSU)、秋水仙堿+尿酸鈉組(Colchicine+MSU組)(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度1μmol/L Colchicine)、青藤堿+尿酸鈉組(SIN+MSU組)(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度300μmol/L SIN)、白芍總苷+尿酸鈉組(TGP+MSU組)(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度40mg/L TGP)、青藤堿+白芍總苷+尿酸鈉組(SIN+TGP+MSU組)(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度300μmol/L SIN+終濃度40mg/L TGP)、秋水仙堿組(Colchicine組)(DMEM+終濃度1μmol/L Colchicine)、青藤堿組(SIN組)(DMEM+終濃度300μmol/L SIN)、白芍總苷組(TGP組)(DMEM+終濃度40mg/L TGP)、青藤堿+白芍總苷組(SIN+TGP組)(DMEM+終濃度300μmol/L SIN+終濃度40mg/L TGP),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24h后,另設(shè)調(diào)零孔(不加細(xì)胞和DMEM),各孔分別加入5 mg/m L MTT 20μl,繼續(xù)孵育4h后,終止培養(yǎng),小心吸棄孔內(nèi)液體,每孔加入150μl DMSO,輕輕振蕩10 min,使結(jié)晶充分溶解,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD值),用各組細(xì)胞OD值與正常組OD值的百分比表示相對(duì)細(xì)胞存活率。3各實(shí)驗(yàn)組藥物干預(yù)與指標(biāo)檢測(cè)將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7巨噬細(xì)胞接種于6孔板,每孔加含血清DMEM培養(yǎng)液2ml,細(xì)胞密度為每孔1.5×106,置于37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜,吸棄上清,PBS洗1-2遍,更換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,分別設(shè)Control組(DMEM)、Model組(DMEM+終濃度50mg/L MSU)、Colchicine組(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度1μmol/L Colchicine)、SIN組(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度300μmol/L SIN)、TGP組(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度40mg/L TGP)、SIN+TGP組(DMEM+終濃度50mg/L MSU+終濃度300μmol/L SIN+終濃度40mg/L TGP),每孔溶液終體積2ml,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)24h,取培養(yǎng)液上清,4℃,3000轉(zhuǎn)/分離心10min后取上清用于ELISA檢測(cè),或收集細(xì)胞用于western blot檢測(cè):(1)硝酸還原酶法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清NO水平;(2)ELISA法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF表達(dá)水平;(3)Western blot法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平。4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件,當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布方差齊時(shí)采用單因素方差分析(one way ANOVA),方差不齊時(shí)采用秩和檢驗(yàn),以P0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1 MSU晶體誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型的建立與0mg/L MSU刺激組相比,6h后50mg/L以上MSU刺激組IL-1β水平均開(kāi)始升高,至24h達(dá)到峰值,48h時(shí)各刺激組IL-1β水平有所下降,在24h,50mg/L MSU刺激組IL-1β水平顯著升高,與0mg/L組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),且鑒于高濃度MSU可能對(duì)細(xì)胞活力產(chǎn)生影響,故選用50mg/L MSU晶體刺激巨噬細(xì)胞24h造模。2細(xì)胞活力與Control組相比,MSU、Colchicine+MSU、SIN+MSU、TGP+MSU、SIN+TGP+MSU、Colchicine、SIN、TGP、SIN+TGP分別處理的各組細(xì)胞相對(duì)細(xì)胞活力無(wú)顯著改變。表明在此實(shí)驗(yàn)條件下,MSU、Colchicine、SIN、TGP沒(méi)有明顯的細(xì)胞毒作用。3各實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清NO分泌水平與Control組相比,Model組分泌NO水平顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Model組相比,各用藥組分泌NO水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Colchicine組相比,SIN組、TGP組及SIN+TGP組分泌NO水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與SIN+TGP組相比,SIN組及TGP組分泌NO水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4各實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞培養(yǎng)上清IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF表達(dá)水平與Model組相比,Colchicine組、SIN組、TGP組及SIN+TGP組IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF的表達(dá)水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Colchicine組相比,SIN+TGP組IL-1β、TNF-α、MCP-1、MIF的表達(dá)水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),IL-8的表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Colchicine組相比,SIN組、TGP組IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1的水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SIN組MIF表達(dá)水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TGP組MIF表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與SIN組相比,TGP組IL-1β、IL-8表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),TNF-α表達(dá)水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與SIN+TGP組相比,TGP組IL-8水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SIN組IL-8表達(dá)水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5各實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平與Model組相比,Colchicine組、SIN組、TGP組及SIN+TGP組My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Colchicine組相比,SIN+TGP組My D88、NF-κB蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯差別,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),SIN組、TGP組My D88、NF-κB蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與Colchicine組相比,SIN組、TGP組及SIN+TGP組ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與SIN組相比,TGP組NF-κB蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與SIN+TGP相比,SIN組、TGP組ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1青藤堿、白芍總苷及其聯(lián)合應(yīng)用均能顯著降低MSU晶體誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞分泌NO、IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIF的水平,具有顯著的抗炎作用;2青藤堿聯(lián)合白芍總苷能夠顯著降低RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥信號(hào)通路中My D88、NF-κB、ASC、Caspase-1蛋白表達(dá)水平,且效果優(yōu)于二者單用;3植物中藥有效成分青藤堿聯(lián)合白芍總苷對(duì)MSU晶體誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型具有多靶點(diǎn)協(xié)同增效抗炎作用,可能是其治療AGA的作用機(jī)制之一。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 路占忠;李振彬;馬旭;宋哲;;采用正交t值法優(yōu)選治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的中藥有效成分復(fù)方配伍[J];解放軍醫(yī)藥雜志;2016年11期

2 曾小峰;陳耀龍;;2016中國(guó)痛風(fēng)診療指南[J];中華內(nèi)科雜志;2016年11期

3 宋哲;路占忠;李振彬;;四妙勇安方水提物對(duì)大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其對(duì)外周血IL-1β、TNF-α和MIF水平的影響[J];解放軍醫(yī)藥雜志;2016年05期

4 包蕾;張惠敏;閔佳鈺;;國(guó)醫(yī)大師王琦治療痛風(fēng)經(jīng)驗(yàn)[J];環(huán)球中醫(yī)藥;2016年05期

5 余靜;謝其冰;鮑曉;馬玲;;白芍總苷膠囊聯(lián)合正清風(fēng)痛寧片治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效觀察[J];西部醫(yī)學(xué);2015年07期

6 孫曉靜;李智杰;杜雪光;范彥博;;中醫(yī)藥治療痛風(fēng)的研究進(jìn)展[J];湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2015年03期

7 楊其彬;何泳龍;青玉鳳;劉璐;周京國(guó);;痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中ASC及其亞型的表達(dá)和意義[J];山東醫(yī)藥;2015年18期

8 路杰;崔凌凌;李長(zhǎng)貴;;原發(fā)性痛風(fēng)流行病學(xué)研究進(jìn)展[J];中華內(nèi)科雜志;2015年03期

9 羅進(jìn)芳;朱瑞麗;易浪;董燕;王培訓(xùn);;青藤堿對(duì)LPS、IL-4誘導(dǎo)的小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的影響[J];中國(guó)免疫學(xué)雜志;2015年01期

10 謝蓓蓓;蘇厚恒;;MSU晶體介導(dǎo)的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥機(jī)制[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年16期

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 張曉坤;單核細(xì)胞趨化蛋白（MCP）-1-2518A/G多態(tài)性與漢族男性痛風(fēng)的相關(guān)性研究[D];青島大學(xué);2013年

，

本文編號(hào)：2540446