【摘要】：背景和目的動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化(coronary atherosclerosis,CAS)性心臟病重要的病理基礎(chǔ),許多研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)是AS的重要病理基礎(chǔ)。核因子E2相關(guān)因子(nuclear factor E2 related factor,Nrf2)是人體內(nèi)抗OS的關(guān)鍵因子,其通過(guò)與抗氧化原件(antioxidant response element,ARE)的結(jié)合來(lái)啟動(dòng)下游的抗氧化基因:血紅素加氧酶(heme oxygenase-1,HO-1)、醌氧化還原酶(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1,NQO1)、超氧化物歧化酶 1(superoxide dismutase 1,SOD1)、超氧化物歧化酶 2(superoxide dismutase 2,SOD2)、過(guò)氧化氫酶(catalase,catalase)來(lái)對(duì)抗OS,因此尋找有效的Nrf2激活劑就自然成為治療AS的新渠道之一。藁本內(nèi)酯是導(dǎo)師顧寧教授創(chuàng)制"寧心痛顆粒"中臣藥川芎的主要活性成分,具有抗炎、抗氧化、保護(hù)心肌細(xì)胞等藥理作用。我們研究團(tuán)隊(duì)前期研究已經(jīng)證實(shí)寧心痛顆粒具有抗粥樣斑塊的作用,但對(duì)其細(xì)胞和分子的多重機(jī)制的闡述尚不完全清楚,因此本研究選擇以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)為干預(yù)目標(biāo),以寧心痛顆粒中主要有效組分藁本內(nèi)酯為研究對(duì)象,探尋其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵機(jī)制"OS"的干預(yù)作用,探討藁本內(nèi)酯影響AS形成及發(fā)展的作用機(jī)制,是前期工作的進(jìn)一步深入和延續(xù)。同時(shí)也為進(jìn)一步深入研究寧心痛顆粒通過(guò)抑制HUVECs的OS損傷從而干預(yù)AS作用機(jī)制、及臨床治療AS與冠心病提供一定依據(jù)。研究方法體外培養(yǎng)HUVECs,使用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT)法檢測(cè)不同劑量下的藁本內(nèi)酯對(duì)HUVECs細(xì)胞活力的影響;應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因法檢測(cè)不同劑量及不同孵育時(shí)間的藁本內(nèi)酯對(duì)于ARE的激活效應(yīng)。實(shí)施逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)法檢測(cè)不同劑量及不同孵育時(shí)間的藁本內(nèi)酯作用于HUVECs后,其對(duì)Nrf2及其下游基因HO-1,NQO1,SOD1,SOD2和CAT的mRNA表達(dá)的影響;應(yīng)用Western Blot法檢測(cè)不同劑量及不同孵育時(shí)間的藁本內(nèi)酯作用于HUVECs后,其對(duì)Nrf2及其下游基因HO-1,NQO1,SOD1,SOD2和CAT的蛋白表達(dá)的影響。根據(jù)上述結(jié)果,選擇能夠最充分激活Nrf2及其下游基因的藁本內(nèi)酯的劑量和作用時(shí)間,應(yīng)用MTT法檢測(cè)藁本內(nèi)酯能否挽救叔丁基過(guò)氧化氫(tert-butyl hydroperoxide,t-BHP)對(duì)HUVECs的損傷;應(yīng)用2,7-二乙酰二氯熒光素(2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)熒光法,觀察藁本內(nèi)酯是否能降低t-BHP所提高的HUVECs中的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)含量。結(jié)果(1)MTT法結(jié)果顯示預(yù)孵育(0-100μM)藁本內(nèi)酯24h,對(duì)HUVECs的細(xì)胞活力沒(méi)有明顯的影響。(2)熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示(1,10,50,100μM)劑量的藁本內(nèi)酯孵育24h,可以誘導(dǎo)出高水平的ARE驅(qū)動(dòng)的熒光素酶活性。其中100μM的效果最好,對(duì)比空白組大約有11.5倍的熒光強(qiáng)度的增加。(3)熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示100μM藁本內(nèi)酯孵育2,4,8,12,24h,可以誘導(dǎo)出高水平的ARE驅(qū)動(dòng)的熒光活性。其中孵育24h的效果最好,對(duì)比空白組大約有11.9倍的熒光強(qiáng)度的增加。(4)使用1,10,50,100μM的藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs24h后,RT-PCR結(jié)果顯示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的 mRNA 表達(dá)量在 1,10,50,100μM 四組中均增多,尤其是在1000μM中增加最多。(5)使用100μM的藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs 2,4,8,12,24h后,RT-PCR結(jié)果顯示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的 mRNA 表達(dá)量在 2,4,8,12,24h 五組中均增多,尤其是在24h中增加最多。(6)使用1,10,50,100μM的藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs 24h后,Western Blot結(jié)果顯示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT 的蛋白表達(dá)量在 1,10,50,100μM 四組中均增多,尤其是在100μM中增加最多。(7)使用100μM的藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs 2,4,8,12,24h后,Western Blot結(jié)果顯示Nrf2、HO-1、NQO1、SOD1、SOD2和CAT的蛋白表達(dá)量在2,4,8,12,24h五組中均增多,尤其是在24h中增加最多。(8)MTT法結(jié)果顯示使用100μM藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs24h,可以有效挽救孵育250 μM t-BHP 6h導(dǎo)致的HUVEC s細(xì)胞活力的降低。(9)DCFH-DA熒光法結(jié)果顯示單獨(dú)使用250μM t-BHP孵育HUVECs 6h細(xì)胞內(nèi)的ROS含量較正常組明顯升高,而使用10OμM藁本內(nèi)酯預(yù)孵育HUVECs 24h,可以有效降低孵育t-BHP導(dǎo)致的HUVECs中增加的ROS含量。結(jié)論藁本內(nèi)酯是有效的Nrf2激活劑,以100μM孵育24h的激活效果最好。藁本內(nèi)酯通過(guò)激活 Nrf2及其下游的 HO-1、NQO1、SOD1、SOD2 和 CAT,清除 ROS,保護(hù) HUVECs,改善血管內(nèi)皮功能,一定程度阻遏AS的進(jìn)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2373117