發(fā)布時(shí)間：2018-11-03 07:56

【摘要】：肝纖維化是由各種致病因子引起的以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積、結(jié)締組織異常增生為特點(diǎn)的肝臟結(jié)構(gòu)和功能的異常病理變化。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是ECM的主要來源,是肝纖維化形成的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。β-arrestin2是arrestin家族成員之一,它是眾所周知的G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors,GPCRs)調(diào)節(jié)蛋白,參與受體的脫敏和內(nèi)化。近年來研究發(fā)現(xiàn),它還可以調(diào)節(jié)許多非GPCRs受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),比如可與TGF-βIII型受體(type III TGF-βreceptor,TβRIII)相互作用參與胞內(nèi)信號(hào)通路,影響細(xì)胞功能。課題組前期研究表明,體外使用β-arrestin2 si RNA轉(zhuǎn)染HSC可抑制其增殖和膠原產(chǎn)生,但尚缺乏整體水平的研究。白芍總苷(total glucosides of paeony,TGP)是從芍藥干燥根中提取的活性部位,其主要成分(40%)是芍藥苷,為提高芍藥苷的生物利用度,經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造合成了芍藥苷-6’-O-苯磺酸酯(paeoniflorin-6’-O-benzene sulfonate,CP-25)。課題組以往研究表明,TGP和芍藥苷均具有減輕肝纖維化的作用,那么CP-25是否也能發(fā)揮抗肝纖維化作用?其是否通過調(diào)節(jié)β-arrestin2發(fā)揮作用呢?為此,本研究首先收集臨床肝纖維化患者組織標(biāo)本,檢測不同程度肝纖維化患者肝臟中β-arrestin2和TβRIII的表達(dá)情況;使用β-arrestin2-/-小鼠建立四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)誘導(dǎo)的肝纖維化模型,觀察整體水平β-arrestin2基因敲除是否可緩解肝纖維化;同時(shí),對CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠灌胃給予CP-25,觀察CP-25是否具有抗肝纖維化作用;進(jìn)一步體外研究選用人肝星狀細(xì)胞株LX-2,轉(zhuǎn)染β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒,探討CP-25可能的作用機(jī)制。目的:收集臨床肝纖維化患者肝臟標(biāo)本,檢測β-arrestin2和TβRIII的表達(dá);分別用野生型(wide type,WT)C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠誘導(dǎo)肝纖維化,觀察肝纖維化形成情況;對CCl_4誘導(dǎo)的野生型肝纖維化小鼠灌胃給予CP-25,觀察CP-25能否能減輕肝纖維化;體外使用β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,再給予CP-25,闡明其作用機(jī)制。方法:選取不同程度肝纖維化患者肝組織石蠟切片,通過免疫組化法檢測β-arrestin2和TβRIII在肝臟中的表達(dá)和分布;用CCl_4將野生型C57BL/6J小鼠和β-arrestin2-/-小鼠誘導(dǎo)為肝纖維化,試劑盒檢測血清轉(zhuǎn)氨酶水平、肝勻漿氧化及抗氧化指標(biāo)、羥脯氨酸含量,CCK-8法檢測T、B淋巴細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測淋巴細(xì)胞亞群的比例,Western blot法檢測肝組織中β-arrestin2、Collagen I、TGF-β1、TβRIII的表達(dá)變化以及Smad2、Smad3、Akt信號(hào)通路的激活情況;CCl_4腹腔注射C57BL/6J小鼠建立肝纖維化模型,分為正常對照組、模型組、CP-25(25、50、100 mg/kg)組、TGP組(100 mg/kg)、秋水仙堿組(0.15 mg/kg),檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)的變化;體外使用β-arrestin2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LX-2細(xì)胞,給予CP-25,觀察LX-2細(xì)胞β-arrestin2、Collagen I、TβRIII的表達(dá)變化以及Smad2、Smad3、Akt信號(hào)通路的激活情況。結(jié)果:1.β-arrestin2、TβRIII在不同程度肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)免疫組織化學(xué)染色法檢測肝內(nèi)膽管結(jié)石和不同程度肝纖維化患者肝臟組織標(biāo)本,結(jié)果顯示,β-arrestin2在肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)明顯高于肝內(nèi)膽管結(jié)石患者,隨著肝纖維化程度的加重,β-arrestin2表達(dá)增加;而TβRIII在肝纖維化患者肝臟中的表達(dá)減少。2.β-arrestin2基因敲除對小鼠肝纖維化的影響用CCl_4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,相比于野生型小鼠,β-arrestin2-/-小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低;肝勻漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、還原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)活力增加,丙二醛(malonaldehyde,MDA)、羥脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量減少;CCK-8檢測顯示T、B淋巴細(xì)胞的增殖被抑制;流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞比例上升,CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降,Th17/Treg比率下降;Western blot結(jié)果顯示,相比于野生型小鼠,β-arrestin2-/-小鼠肝組織中β-arrestin2幾乎不表達(dá),Collagen I、TGF-β1表達(dá)下降,TβRIII的表達(dá)增加,p-Smad2、p-Smad3、p-Akt的表達(dá)均下降,而Smad2、Smad3、Akt的表達(dá)無明顯變化。3.CP-25對CCl_4誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠纖維化的影響與肝纖維化模型組相比,灌胃給予CP-25后,小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平降低;肝臟中SOD、GSH活力增加,MDA、Hyp含量減少;CCK-8檢測顯示T、B淋巴細(xì)胞的增殖被抑制;脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞比例上升,CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降,Th17/Treg比率下降;Western blot結(jié)果顯示,CP-25可降低肝組織Collagen I和β-arrestin2的表達(dá)。4.CP-25對β-arrestin2過表達(dá)的LX-2細(xì)胞中Collagen I、β-arrestin2和TβRIII表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,TGF-β1刺激使LX-2細(xì)胞I型膠原表達(dá)增加,CP-2510-8~10-5 mol/L可抑制LX-2細(xì)胞中I型膠原的生成;向LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p EGFP-C2-arrestin2質(zhì)粒,β-arrestin2、Collagen I的表達(dá)均增加,而TβRIII的表達(dá)降低,給予CP-25可降低β-arrestin2、Collagen I的表達(dá),增加TβRIII的表達(dá)。5.CP-25對β-arrestin2過表達(dá)的LX-2細(xì)胞中Smad2、Smad3和Akt信號(hào)通路激活的影響Western blot結(jié)果顯示,LX-2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染高表達(dá)b-arrestin2質(zhì)粒后,p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表達(dá)均增加,而Smad2、Smad3和Akt的表達(dá)無明顯變化;CP-25可抑制Smad2、Smad3和Akt信號(hào)的激活。結(jié)論:1.在不同程度肝纖維化患者的肝臟標(biāo)本中,隨著纖維化程度的加重,β-arrestin2表達(dá)增加,提示β-arrestin2可能與纖維化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。2.相比于野生型肝纖維化小鼠,β-arrestin2-/-小鼠肝纖維化程度明顯減輕,脾臟CD4+CD62L+T細(xì)胞比例上升,CD4+CD69+T細(xì)胞比例下降,Th17/Treg比率下降;肝臟TβRIII表達(dá)增加,p-Smad2、p-Smad3、p-Akt的表達(dá)降低,提示β-arrestin2基因敲除可能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞亞群比例、抑制Smad2、Smad3和Akt信號(hào)通路的激活,減輕小鼠肝纖維化。3.CP-25灌胃給予肝纖維化小鼠可降低轉(zhuǎn)氨酶水平,減少肝臟中羥脯氨酸含量和Collagen I、β-arrestin2水平,升高CD4+CD62L+T細(xì)胞比例,降低CD4+CD69+T細(xì)胞比例和Th17/Treg比率,提示CP-25可發(fā)揮抗肝纖維化作用。4.體外給予CP-25,可抑制過表達(dá)β-arrestin2的LX-2細(xì)胞中Collagen I表達(dá)的增加,及Smad2、Smad3、Akt信號(hào)的激活,促進(jìn)TβRIII表達(dá)增加,提示CP-25可能通過抑制β-arrestin2的表達(dá),增強(qiáng)了TβRIII對Smad2、Smad3、Akt信號(hào)通路的抑制作用,從而減輕肝纖維化。
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【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2307179