本文選題：細(xì)胞固相色譜法 + 牡丹皮水提液��； 參考：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:建立MC3T3-E1成骨細(xì)胞固相色譜方法,研究骨折合劑君藥牡丹皮促進(jìn)骨折愈合的效應(yīng)物質(zhì);并應(yīng)用MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖和分化效應(yīng)驗(yàn)證所得結(jié)合物質(zhì)的活性,為牡丹皮在臨床治療骨折提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為骨折合劑的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)。方法:采用Agilent5TC-C18色譜柱,0.4%的甲酸水溶液-乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫,檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm,柱溫為30℃,進(jìn)樣量為5μL,流速為1mL·min-1,建立牡丹皮水提液的指紋圖譜,并對(duì)其三個(gè)主要成分沒(méi)食子酸、芍藥苷和丹皮酚進(jìn)行定量研究。建立MC3T3-E1成骨細(xì)胞固相色譜法:采用高溫滅菌法處理牡丹皮水提液,藥液與MC3T3-E1成骨細(xì)胞共同孵育4 h,洗脫4次后將細(xì)胞失活,使結(jié)合效應(yīng)成分解離下來(lái),再將細(xì)胞進(jìn)行裂解,使進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)成分釋放出來(lái)。應(yīng)用HPLC和HPLC/MS對(duì)解離液和裂解液中的物質(zhì)成分進(jìn)行分析。采用MTT法和ALP活性測(cè)定法,研究篩選出的準(zhǔn)活性成分對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞活性的影響。結(jié)果:得到10批牡丹皮的對(duì)照指紋圖譜和共有峰30個(gè),其中4號(hào)色譜峰為沒(méi)食子酸、7號(hào)色譜峰為沒(méi)食子酸甲酯、14號(hào)色譜峰為芍藥內(nèi)酯苷、16號(hào)色譜峰為芍藥苷、21號(hào)色譜峰為1,2,3,4,6-O-五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)、30號(hào)色譜峰為丹皮酚。各批次牡丹皮水提液的指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜相似度均大于0.9。三個(gè)主成分方法學(xué)考察的結(jié)果顯示:沒(méi)食子酸、芍藥苷和丹皮酚的線性范圍分別在1.691～270 μg·mL-1(R2=0.9997)、1.847～250 μg·mL-1(R2=0.9999)、0.181～29.0μg·mL-1(R2=0.9999)與峰面積呈良好的線性關(guān)系;平均回收率(n=3)在94.12%～100.01%;含量測(cè)定結(jié)果顯示,牡丹皮中沒(méi)食子酸、芍藥苷和丹皮酚的平均含量分別為 0.34%、0.54%和 0.0091%,RSD 分別為 5.01%、5.40%和 2.41%。應(yīng)用MC3T3-E1成骨細(xì)胞固相色譜法,篩選分析得到4個(gè)主要的準(zhǔn)活性成分,其中與細(xì)胞膜結(jié)合的成分為沒(méi)食子酸和1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG),進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部的成分為沒(méi)食子酸甲酯和芍藥內(nèi)酯苷。藥理學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示:0.6～1.6 mg/mL的沒(méi)食子酸對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖與分化均具有明顯的促進(jìn)作用(P0.05,0.001);0.5～1.0 mg/mL的沒(méi)食子酸甲酯對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖與分化均具有明顯的促進(jìn)作用(P0.05,0.01,0.001);4.0 mg/mL的芍藥內(nèi)酯苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖具有明顯的促進(jìn)作用(P0.05),但0.5～4.0 mg/mL的芍藥內(nèi)酯苷對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的分化具有抑制作用;1.2mg/mL的1,2,3,4,6-0-五沒(méi)食子酰葡萄糖對(duì)MC3T3-E1成骨細(xì)胞的增殖與分化均具有明顯的促進(jìn)作用(P0.05,0.01)。結(jié)論:1)本課題建立的牡丹皮水提液的HPLC指紋圖譜,方法簡(jiǎn)便、重復(fù)性好;沒(méi)食子酸、芍藥苷和丹皮酚多成分檢測(cè)的方法學(xué)考察結(jié)果表明,該分析方法穩(wěn)定可靠,為本課題牡丹皮的提取工藝提供質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。2)本課題建立的MC3T3-E1成骨細(xì)胞固相色譜法通過(guò)驗(yàn)證,說(shuō)明方法可行性,可用于牡丹皮促進(jìn)骨折愈合成分的篩選。3)通過(guò)課題研究,初步確定牡丹皮中促進(jìn)骨折愈合的效應(yīng)物質(zhì)為沒(méi)食子酸、沒(méi)食子酸甲酯與1,2,3,4,6-五沒(méi)食子酰葡萄糖(PGG)。
[Abstract]:Objective: to establish a solid phase chromatography of MC3T3-E1 osteoblast to study the effect substance of fracture healing agent peony skin to promote fracture healing, and to verify the activity of the combined substance using the proliferation and differentiation effect of MC3T3-E1 osteoblast, and provide the basis for the clinical treatment of fracture of peony skin, and also provide the further development of fracture mixture. Methods: using Agilent5TC-C18 column, 0.4% formic acid solution - acetonitrile for mobile phase gradient elution, detection wavelength of 254nm, column temperature of 30 C, 5 mu L and 1mL. Min-1, the fingerprint of water extract of peony skin was established, and the quantitative study on three main ingredients gallic acid, paeoniflorin and paeonol was established. MC 3T3-E1 osteoblast solid phase chromatography: the aqueous extract of peony skin was treated with high temperature sterilization. The liquid was incubated with MC3T3-E1 osteoblasts for 4 h. The cells were deactivated after 4 times of elution, and the combined effect components were dissociated and the cells were cracked to release the effect into the cells. HPLC and HPLC/MS were applied to the dissociation fluid and crack. Analysis of the substances in the solution. The effects of the selected quasi active components on the activity of MC3T3-E1 osteoblasts were studied by MTT and ALP activity. Results: the control fingerprint and the total peak of 10 batches of peony were obtained. 30 of the peaks were gallic acid, the peak of No. 7 was methyl gallate, and the peak of No. 14 was peony. The peak of No. 16 chromatographic peak is paeoniflorin, the peak of No. 21 is 1,2,3,4,6-O- five galloyl glucose (PGG), and the peak of No. 30 is paeonol. The similarity of the fingerprint and the control map of the water extracts of each batches of peony peel are greater than that of the three principal component methods of 0.9.. 1.691 to 270 mu g / mL-1 (R2=0.9997), 1.847 to 250 mu g mL-1 (R2=0.9999), 0.181 ~ 29 G. ML-1 (R2=0.9999) had a good linear relationship with peak area. The average recovery rate (n=3) was 94.12% to 100.01%. The content determination showed that the average content of paeoniflorin in Peony peel was 0.34%, 0.54% and 0, respectively. .0091%, RSD are 5.01%, 5.40% and 2.41%. using MC3T3-E1 osteoblast solid phase chromatography, and 4 major quasi active components are screened and analyzed. The components of the cell membrane are gallic acid and 1,2,3,4,6- five galloyl glucose (PGG), and the components into the cells are methyl gallate and paeoniflorin. The results showed that 0.6 ~ 1.6 mg/mL gallic acid had an obvious promoting effect on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts (P0.05,0.001); 0.5 ~ 1 mg/mL gallate methyl gallate had an obvious promoting effect on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts (P0.05,0.01,0.001); 4 mg/mL of paeoniflorin to MC3T3-E1 The proliferation of osteoblasts had an obvious promoting effect (P0.05), but 0.5 ~ 4 mg/mL of paeoniflorin had inhibitory effect on the differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts; 1,2,3,4,6-0- five galloyl glucose of 1.2mg/mL had an obvious promoting effect on the proliferation and differentiation of MC3T3-E1 osteoblasts (P0.05,0.01). Conclusion: 1) the establishment of this subject was established. The HPLC fingerprint of the water extract of peony skin is simple and reproducible. The method of detecting the multicomponent analysis of gallic acid, paeoniflorin and paeonol shows that the method is stable and reliable, and provides quality control standard.2 for the extraction process of peony skin in this subject. The solid phase chromatography of MC3T3-E1 osteoblasts established by this project has been verified by the method of solid phase chromatography. To illustrate the feasibility of the method, it can be used to screen.3 for healing of fracture healing in Peony skin). Through the study of the subject, the effects of gallic acid, methyl gallate and 1,2,3,4,6- five galloyl glucose (PGG) are preliminarily identified in the skin of peony skin.
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R284;R285

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本文編號(hào)：1989248