本文選題：枳實 + 枳殼　； 參考：《北京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantuL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantium L及其栽培變種的干燥未成熟果實。枳實、枳殼中化學(xué)成分復(fù)雜多樣,包括黃酮類,香豆素類、生物堿類、揮發(fā)類、檸檬苦素類。黃酮和香豆素為枳實和枳殼中的主要化學(xué)成分,具有抗氧化,抗過敏,抗炎,抗腫瘤,升壓,強心,促進胃腸功能等作用。這些化合物溶解度及含量存在較大差異,且樣品中其他共存雜質(zhì)成分存在較大的干擾,為其樣品的制備及準(zhǔn)確定量帶來極大的挑戰(zhàn)。目前中藥主要以某一個或者少數(shù)幾個指標(biāo)進行提取工藝篩選,但是中藥是一個復(fù)雜的體系,其主要通過整體化合物的吸收發(fā)揮作用。因此本文首先采用固相萃取法對枳實和枳殼進行純化和富集,分別得到二者的總的活性黃酮和香豆素化合物,對其化合物進行檢測并建立不同品種枳實的指紋圖譜研究。進一步采用PAMPA模型,從單體、中藥整體體外吸收兩個層面對枳實和枳殼進行提取工藝的快速篩選研究。以探索枳實與枳殼中有效成分的差異及腸吸收可能存在的機制,為枳實和枳殼質(zhì)量評價方法提供重要依據(jù),同時從生物利用度角度為枳實枳殼樣品提取工藝的制備提供新方法。1.枳實枳殼中活性化合物的純化富集與檢測1.1枳實枳殼提取工藝的研究制訂合理的提取工藝,是保證療效的關(guān)鍵。為了確定有效成分最佳提取工藝,首先比較了提取方式回流與超聲的提取效果,進一步以析因設(shè)計進行提取關(guān)鍵因素篩選,最后以關(guān)鍵因素甲醇濃度、溶劑倍數(shù)、提取時間為考察因素,采用采用正交設(shè)計法優(yōu)化提取工藝。以枳殼中16個活性成分圣草次苷、蕓香柚皮苷、橙皮苷、柚皮苷、新橙皮苷、橙皮素、柚皮素、野漆樹苷、川陳皮素、甜橙黃酮、5-去甲川陳皮素、橘皮素、7-OH香豆素、佛手柑內(nèi)酯、橙皮油素、佛手柑素為指標(biāo)�？紤]含量高低懸殊,通過多指標(biāo)綜合評分法來對數(shù)據(jù)進行分析,評價不同提取工藝的提取效果。確定最佳提取工藝為:采用超聲提取法,以125倍量75%甲醇作為提取溶劑,提取時間為30 min。1.2枳實枳殼固相萃取方案的優(yōu)化枳實、枳殼中化合物種類較多,成分復(fù)雜,溶解度及含量存在較大差異。有些成分的含量比較低,容易受樣品其他雜質(zhì)成分的干擾,影響其準(zhǔn)確定量。因此借助固相萃取法操作簡便、集提取與分離于一體,且對微量成分具有較好的除雜與富集作用等優(yōu)勢,將其應(yīng)用于枳實與枳殼的富集與純化。以枳實和枳殼中20種不同結(jié)構(gòu)類型的黃酮及香豆素為研究對象,從固相萃取小柱填料的篩選、穿透體積、淋洗溶劑及洗脫溶劑、洗脫體積對固相萃取條件進行優(yōu)化,篩選出最佳純化與富集方案為:固相萃取小柱以Strata-X填料,以2mL甲醇和5mL水平衡對小柱進行前處理,穿透體積為23mL,上樣后以2 mL 30%的甲醇淋洗雜質(zhì),再以10 mL 100%的甲醇洗脫目標(biāo)成分。結(jié)果顯示通過固相萃取法,枳實枳殼提取物中總黃酮及香豆素化合物的含量提高了 35.55%—68.48%。提示固相萃取法具有很好的純化富集作用。1.3枳實枳殼的含量測定研究固相萃取法優(yōu)化方案確定后,我們將其應(yīng)用于50批次不同品種的枳實與枳殼的含量測定及分類鑒別中。考慮待測成分化學(xué)類型多樣性,采用HPLC多波長切換法進行檢測,建立了枳實枳殼中20種黃酮和香豆素類成分快速檢測及識別方法。線性范圍、準(zhǔn)確度、精密度、重復(fù)性、加樣回收率、方法學(xué)考察結(jié)果顯示,該方法穩(wěn)定可靠,可以作為枳實枳殼中20種化合物的含量測定方法。結(jié)果表明在同品種不同生長階段枳實和枳殼中各類化學(xué)成分,包括二氫黃酮、多甲氧基黃酮、香豆素的含量,枳實均高于枳殼。而在不同品種枳實中新橙皮苷、柚皮苷在分布和含量上均呈現(xiàn)較大的差異。借助多元統(tǒng)計分析軟件,我們實現(xiàn)了對不同品種的枳實與同品種不同生長階段的枳殼進行分類鑒別。總的來說,固相萃取法在枳實枳殼分類鑒別的前處理方面具有很好的應(yīng)用價值。1.4不同品種指紋圖譜研究采用HPLC-DAD方法建立18個批次酸橙枳實以及10個批次甜橙枳實的指紋圖譜,通過對照品對照和紫外圖譜指認(rèn)了 17個色譜峰并對其進行含量測定。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004A)軟件進行指紋圖譜分析,進一步通過SIMCA-P 13.0軟件對17個確認(rèn)的成分含量進行最小二乘法判別分析,確定區(qū)分酸橙枳實與甜橙枳實的差異性標(biāo)記物。結(jié)果表明新橙皮苷、柚皮苷、野漆樹苷、橘皮素、橙皮素、5-去甲川陳皮素、橙皮油素,這些成分是造成不同品種枳實質(zhì)量之間差異貢獻較大的成分,對不同品種枳實的聚類分析具有顯著性影響。該方法具有良好的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性,為枳實的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)。2.枳實、枳殼活性化學(xué)成分的PAMPA快速篩選研究為探討枳實枳殼中活性化合物的吸收情況及腸吸收可能存在的機制,為枳實枳殼的藥物制備提供新方法,進行了以下研究。2.1 PAMPA模型的建立與質(zhì)量評價采用大豆卵磷脂溶解在十二烷中作為膜材料在96孔過濾板上建立人工膜以模擬小腸上皮細(xì)胞膜,通過膜體積和濃度的優(yōu)化,采用外觀觀察、熒光素鈉檢漏及四種陽性對照藥普萘洛爾、卡馬西平、華法林、呋塞米評價三種方式進行膜質(zhì)量的考察方法。結(jié)果顯示:采用濃度為5%的大豆卵磷脂,建立體積為10 μL的人工膜結(jié)構(gòu)完整,質(zhì)量可靠,可以作為PAMPA模型進行快速篩選研究。2.2 PAMPA模型上單體化合物的篩選研究對文獻報道的枳實、枳殼中存在的43個不同結(jié)構(gòu)類型的單體化學(xué)成分進行PAMPA篩選研究。借助HPLC-QqQ-MS/MS法的優(yōu)勢,實現(xiàn)了對43個成分在25 min內(nèi)的快速分析,并計算各單體化合物在高、中、低三個濃度梯度下的有效滲透系數(shù)值。結(jié)果顯示有效滲透系數(shù)值是化合物的固有性質(zhì),與濃度無關(guān)。不同結(jié)構(gòu)類型的有效滲透系數(shù)值表明香豆素類成分,多甲氧基黃酮類,二氫黃酮苷元,黃酮苷元及檸檬苦素類成分的小腸吸收較好,而糖苷類成分吸收較差。2.3 PAMPA模型上中藥整體提取物的篩選研究中藥臨床用藥以整體發(fā)揮療效,因此采用PAMPA模型建立中藥整體的篩選研究具有重要意義。采用不同溶劑提取、固相萃取法進行純化處理,得到枳實、枳殼的不同提取物組分,用于PAMPA模型的篩選研究。結(jié)果表明在中藥整體提取物中共存成分對吸收有一定的影響,某些成分如橙皮苷、野漆樹苷、地奧司明,表現(xiàn)出吸收促進的作用,可能與增加溶解度有關(guān)。中藥整體提取物經(jīng)過固相萃取法純化后,吸收進一步增強。這建小結(jié):本文主要進行了兩個方面的工作:1.采用固相萃取法確立了枳實枳殼樣品中酚性化學(xué)成分的純化與富集方案,結(jié)合HPLC-DAD多波長切換法對不同品種枳實與同品種不同生長階段枳實和枳殼進行分類鑒別的研究。結(jié)果顯示不同品種枳實之間化學(xué)成分在質(zhì)上存在較大差異,而同品種不同生長階段之間枳實與枳殼主要存在量上的差異,隨著生長時間的延長,酚性化學(xué)成分包括黃酮類,二氫黃酮類,多甲氧基黃酮類以及香豆素類,含量均呈現(xiàn)降低的趨勢,臨床用藥枳實藥效比枳殼迅猛,其功效的差異可能與含量的差異有關(guān)。此研究為枳實枳殼臨床合理用藥提供依據(jù)。2.采用PAMPA體外吸收模型對枳實枳殼中單體及整體提取物的快速篩選研究。單體化合物研究顯示化合物的吸收滲透系數(shù)值是化合物的固有屬性,與濃度無關(guān),且吸收的強弱與化合物的脂溶性呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。中藥作為一個整體其內(nèi)部成分之間存在相互作用,影響其吸收。通過固相萃取法純化處理可以除去一些干擾吸收的組分,促進化合物的吸收。提示在中藥提取制備中既要考慮內(nèi)部化合物之間的配伍作用,又要對其進行提純,對一些干擾組分進行處理,使中藥在一個比較適當(dāng)?shù)募兌确秶鷥?nèi)發(fā)揮其最佳吸收,提高其生物利用度。此研究從生物利用度的角度為中藥制備提供新方法。
[Abstract]:A method for extracting Fructus Aurantii Immaturus from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii may be selected from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii . A method for the determination of 20 kinds of flavonoids and coumarin from Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii by means of multi - index comprehensive scoring method is used to determine the content of 20 kinds of flavone and coumarin in Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii . A new method for the determination of immature bitter orange in immature bitter orange was carried out . The results showed that the method has good precision , stability and repeatability , and it can be used as a new method for the quality control and evaluation of immature bitter orange . In this paper , a new method for the determination of the chemical components of Fructus Aurantii Immaturus and Fructus Aurantii by solid - phase extraction is studied . The results show that the absorption and permeability coefficient of Fructus Aurantii Immaturus is different from that of Fructus Aurantii .
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284.1

【參考文獻】

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本文編號：1979797