本文選題：龍葵堿 + 黑色素瘤　； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:黑色素瘤(malignant melanoma,MM)是一種高度惡性的腫瘤,占皮膚惡性腫瘤的第三位,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,死亡率高,預(yù)后差。因此尋找安全有效的治療藥物成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。各國(guó)學(xué)者一直致力于研發(fā)高效、敏感的抗黑色素瘤藥物。目前,中草藥及其有效成分是腫瘤研究領(lǐng)域的一個(gè)新方向。龍葵堿(solanine)又名茄堿,是馬鈴薯中一種主要的甾體生物堿。近年來(lái)發(fā)現(xiàn),龍葵堿具有抗病原微生物、抗腫瘤等作用,其抗腫瘤作用受到眾多學(xué)者關(guān)注。目前,已有研究證實(shí)龍葵堿對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,但其對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的抑制作用研究很少。本研究主要通過龍葵堿處理黑素瘤A375細(xì)胞,觀察其對(duì)A375細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的影響,探討龍葵堿可能的抗腫瘤作用機(jī)制,為其進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法:1細(xì)胞培養(yǎng)。將黑色素瘤A375細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,放入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2采用CCK8法檢測(cè)龍葵堿對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞增殖抑制率的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組(只加培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞無(wú)龍葵堿),陰性對(duì)照組(加含有細(xì)胞的培養(yǎng)基,無(wú)龍葵堿)和實(shí)驗(yàn)組(加含有細(xì)胞的培養(yǎng)基和以下濃度的龍葵堿4.6μmol/L、9.2μmol/L、13.8μmol/L、18.4μmol/L、23.0μmol/L),每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h、48 h、72h后加入CCK8檢測(cè)龍葵堿對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞增殖活力的影響,計(jì)算不同濃度的增值抑制率及IC50值。3倒置顯微鏡和熒光顯微鏡觀察不同濃度的龍葵堿誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化。設(shè)陰性對(duì)照組(無(wú)龍葵堿)及實(shí)驗(yàn)組(龍葵堿濃度為9.2μmol/L、13.8μmol/L、18.4μmol/L)。培養(yǎng)24小時(shí)后分別于倒置顯微鏡和DAPI染色后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況及形態(tài)學(xué)變化。4應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因(Caspase-3、Bcl-2及Bax)在mRNA水平的表達(dá)。5應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、bcl-2及bax)的表達(dá)情況。6應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件spss16.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料以x?s表示,多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析(onewayanova),組內(nèi)兩兩比較采用snk-q檢驗(yàn),以p0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1未經(jīng)龍葵堿作用的黑色素瘤a375細(xì)胞呈菱形生長(zhǎng),大小一致,形態(tài)規(guī)整,細(xì)胞貼壁良好,增殖旺盛(fig.2,3);2cck8結(jié)果示,不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤a375細(xì)胞24h抑制率分別為(2.0±2.4)%、(11.4±1.4)%、(36.6±1.8)%、(63.7±0.3)%、(68.4±1.4)%,經(jīng)兩兩比較4.6μmol/l與陰性對(duì)照組的抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);作用48h抑制率分別為(7.6±3.0)%、(15.3±2.8)%、(60.9±3.4)%、(76.6±2.9)%、(78.6±3.8)%,經(jīng)兩兩比較18.4μmol/l與23.0μmol/l的抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);作用72h抑制率分別為(16.3±1.4)%、(28.7±3.7)%、(64.8±4.4)%、(95.8±1.2)%、(101.1±4.5)%,經(jīng)兩兩比較18.4μmol/l與23.0μmol/l的抑制率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(fig.4,5,table1)。實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用黑色素瘤a375細(xì)胞24h、48h、72h的半數(shù)抑制濃度(ic50)分別是16.2μmol/l、12.9μmol/l、11.8μmol/l。因此我們選取9.2μmol/l、13.8μmol/l、18.4μmol/l的龍葵堿濃度作用24h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);3倒置顯微鏡下觀察,陰性對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)規(guī)整,輪廓清楚,大小一致,胞漿飽滿,遮光性強(qiáng),細(xì)胞貼壁良好且增殖旺盛;實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用24h細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,體積變小,輪廓不規(guī)整,細(xì)胞皺縮,遮光性差,細(xì)胞脫落,貼壁不良,懸浮細(xì)胞增多(fig.6,7)。dapi染色后通過熒光顯微鏡觀察,陰性對(duì)照組細(xì)胞核大小一致,均勻分布,實(shí)驗(yàn)組龍葵堿作用24h細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮、核邊集及凋亡小體形成(fig.8)。且隨著龍葵堿濃度的升高,細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化越顯著;4rt-qpcr結(jié)果示,不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤a375細(xì)胞24h,bax基因在mrna水平表達(dá)量依次為1.370±0.335,1.721±0.711,2.371±0.494,陰性對(duì)照組為1.064±0.516,經(jīng)兩兩比較對(duì)照組與9.2μmol/l、13.8μmol/l與18.4μmol/l之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.9,Table 2);Caspase-3基因在mRNA水平表達(dá)量依次為1.346±0.289,1.619±0.299,2.338±0.033,對(duì)照組為1.018±0.267,經(jīng)兩兩比較對(duì)照組、9.2μmol/L與13.8μmol/L之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.11,Table 2);Bcl-2基因在m RNA水平表達(dá)量依次為0.975±0.109,0.705±0.228,0.360±0.110,對(duì)照組為1.007±0.166,經(jīng)兩兩比較對(duì)照組與18.4μmol/L、9.2μmol/L與18.4μmol/L之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.10,Table 2);5 Western blot結(jié)果示,不同濃度的龍葵堿作用黑色素瘤A375細(xì)胞24h,Bax蛋白表達(dá)量依次為0.543±0.049,0.824±0.059,0.857±0.046,陰性對(duì)照組為0.440±0.039,經(jīng)兩兩比較濃度為13.8μmol/L與18.4μmol/L之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.12,13,Table 3);Caspase-3蛋白表達(dá)量依次為0.409±0.050,0.526±0.029,0.613±0.050,陰性對(duì)照組為0.403±0.037,經(jīng)兩兩比較濃度為9.2μmol/L與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.12,15,Table 3);Bcl-2蛋白表達(dá)量依次為0.275±0.026,0.145±0.018,0.045±0.018,陰性對(duì)照組為0.254±0.021,經(jīng)兩兩比較濃度為9.2μmol/L與陰性對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(Fig.12,14,Table 3)。結(jié)論:1在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),龍葵堿對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用,且呈時(shí)間-劑量依賴性。2在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),龍葵堿可誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞凋亡,且隨著濃度的升高,誘導(dǎo)凋亡作用越顯著。3龍葵堿誘導(dǎo)黑色素瘤A375細(xì)胞的凋亡作用可能與線粒體凋亡通路有關(guān),通過下調(diào)Bcl-2/Bax值從而使caspase-3活化。
[Abstract]:Objective : To study the effect of the tumor on the proliferation , apoptosis and apoptosis of melanoma A375 cells . The results showed that the tumor cells could inhibit the proliferation , apoptosis and apoptosis of melanoma A375 cells . The expression of Caspase - 3 , Bcl - 2 and Bax were detected by real - time quantitative polymerase chain reaction ( RT - qPCR ) . The results showed that the inhibition rates were ( 16.3 鹵 1.4 ) % , ( 64.9 鹵 3.4 ) % , ( 95.8 鹵 1.2 ) % , ( 101.1 鹵 4.5 ) % , respectively . Conclusion : In a certain concentration and time , the A375 cells can induce apoptosis of melanoma A375 cells in a time - dose - dependent manner . The apoptosis of melanoma A375 cells can be induced with the increase of concentration and time , and the apoptosis of A375 cells may be related to the pathway of apoptosis , and caspase - 3 can be activated by downregulating the Bcl - 2 / Bax value .
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 彭偉;駱泓潔;元小冬;;死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J];生命的化學(xué);2016年05期

2 周怡;李影;孔鴻儒;張青順;周蒙滔;孫洪偉;;龍葵堿對(duì)胰腺癌細(xì)胞裸鼠移植瘤的抑制作用及機(jī)制研究[J];肝膽胰外科雜志;2016年03期

3 趙逸斌;鄧科;楊少輝;崔，

本文編號(hào)：1968075