本文選題：3D生物打印 + 功能性自組裝納米多肽��； 參考：《山東大學》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景我們可以在多種組織中找到間充質干細胞,它是一種擁有多向分化潛能的多功能干細胞,其具有容易分離擴增、多向分化和低免疫原性等特性。研究發(fā)現(xiàn)脂肪來源的間充質干細胞(Ad-MSCs)相對于其他干細胞,具有來源充足,取材方便,低創(chuàng)即得,易分離培養(yǎng),生物學性狀穩(wěn)定等特征,因此研究者普遍認為其在組織工程學和再生醫(yī)學中是一種更為理想的種子細胞。構成組織工程學支架的材料需要具備良好的生物相容性,較強可塑性,抗張強度大和無免疫原性等特點。目前制備支架的常用材料包括膠原蛋白酶、聚乳酸、海藻酸鹽等材料。但這些生物材料都其相應的局限性,現(xiàn)實實驗條件下對這些生物材料進行可控研究難度較大。近年來,以多肽為基本組成結構單元,依靠納米多肽分子自組裝得到的納米組織工程學框架材料已成為組織工程領域新的研究熱點,這類納米多肽生物材料具有良好的生物兼容性、降解性,且最為突出的優(yōu)點是其具有生物活性。隨著3D打印技術的興起和快速發(fā)展,3D打印已開始廣泛應用于醫(yī)學領域,為精準化、個性化醫(yī)療提供條件,現(xiàn)階段對組織工程學高精密度打印也已進入深入的探索和研究。以自組裝多肽納米溶液負載Ad-MSCs為"生物墨汁"利用3D生物打印技術打印出三維結構,通過體外培養(yǎng)3D打印模型內的Ad-MSCs,并給予不同誘導分化條件,觀察其內細胞的生長狀態(tài)及分化程度,研究功能性自組裝納米多肽作為負載Ad-MSCs的3D打印材料的可行性,探尋3D打印新的發(fā)展方向。研究目的本實驗豈在研究以自組裝納米多肽與人脂肪間充質干細胞(Ad-MSCs)為"生物墨汁",利用3D打印技術,制造組織工程學模型,觀察其內細胞生長狀態(tài)及多向分化能力。希望借此找到新的組織工程學材料。研究方法1.分離、培養(yǎng)原代Ad-MSCs,傳代至P2、P3后用于后續(xù)實驗;使用流式細胞儀對細胞進行細胞免疫表型鑒定并軟件分析;對細胞進行鬼筆環(huán)肽染色,觀察細胞微絲形態(tài);對細胞分別成內皮、成骨、成脂誘導分化,并進行鑒定。2.用10%蔗糖-去離子水溶液溶解三種多肽(RADA16-I、RGD、KLT),分別按所需濃度和體積比混合并原子力顯微鏡(Olympus公司)觀察;將混合溶液放入Transwell成膠,成膠后進行掃描電鏡觀察;將三種多肽與細胞混合并成膠后進行培養(yǎng),并觀察多肽內細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。3.以自組裝納米多肽、Ad-MSCs混合溶液為"生物墨汁"利用3D生物打印技術打印組織工程學模型:打印后切片進行鬼筆環(huán)肽熒光染色并觀察;誘導3D模型中的Ad-MSCs成骨和成脂分化,誘導完成后分別進行茜素紅S、油紅0染色,并與對比組進行染色比較。研究結果1.倒置相差顯微鏡下可見Ad-MSCs為梭形,整體呈現(xiàn)出漩渦狀生長趨勢;流式細胞儀鑒定可見分離、培養(yǎng)的細胞CD166,CD90,CD29表達陽性,不表達CD31、CD34、CD45和HLA-DR,符合Ad-MSCs免疫表型。鬼筆環(huán)肽染色后可見細胞內微絲結構;成骨、成脂誘導分化后可見細胞內出現(xiàn)相關染色劑著色現(xiàn)象。2.原子力顯微鏡觀察納米多肽溶液,可見其內有納米纖維結構;納米多肽水凝膠無色透明,含水量豐富;掃描電鏡觀察水凝膠,見其內納米纖維結構并有孔隙;細胞與水凝膠混合成膠并培養(yǎng)后觀察可見其內細胞排列緊密,生長狀態(tài)良好。3.利用"生物墨汁"打印出組織工程模型,切片染色后可見其內的細胞生長狀態(tài)良好,貼壁緊密。對模型內的Ad-MSCs進行誘導分化,并分別對實驗組和對照組進行相關染色,茜素紅S染色可見成骨誘導實驗組中鈣結節(jié)形成,油紅0染色可見成脂誘導實驗組Ad-MSCs內脂滴著色,兩對照組不著色。結論以自組裝納米多肽、脂肪間充質干細胞混合溶液為"生物墨汁" 3D打印出的組織工程學模型內Ad-MSCs生長狀態(tài)良好,仍具有較強的分化能力。
[Abstract]:Research background we can find mesenchymal stem cells in a variety of tissues. It is a multifunctional stem cell with multidirectional differentiation potential. It has the characteristics of easy separation and amplification, multidifferentiation and low immunogenicity. It is found that fat derived mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) are abundant in source and are obtained from other stem cells. It is widely believed that it is a more ideal seed cell in tissue engineering and regenerative medicine. The material of tissue engineering scaffold needs good biocompatibility, strong plasticity, strong tensile strength, and no immunogenicity. The commonly used materials for the preparation of scaffolds include collagenase, polylactic acid, alginate and other materials. However, these biomaterials have their respective limitations. Under the actual experimental conditions, it is difficult to study these biomaterials. In recent years, polypeptides are the basic structure units and self-assembled by nanoscale peptides. Nanoscale tissue engineering frame material has become a new research hotspot in the field of tissue engineering. This kind of nano peptide biomaterial has good biocompatibility, degradability and the most outstanding advantage is its biological activity. With the rise and rapid development of 3D printing technology, 3D printing has been widely used in the medical field and is accurate. At the present stage, the high precision printing of tissue engineering has also been deeply explored and studied. With the self assembled polypeptide nano solution load Ad-MSCs as "biological ink", the three-dimensional structure is printed by 3D biologic printing technology, and the Ad-MSCs in the 3D printing mold type is cultured in vitro, and the different inducible differentiation strips are given. To observe the growth state and degree of differentiation of the cells in the Ad-MSCs, the feasibility of functional self-assembled nano peptide as the 3D printing material of the load is studied, and the new development direction of 3D printing is explored. The purpose of this study is to study the use of 3D to print the self assembled nano peptides and human fat mesenchymal stem cells (Ad-MSCs) as "biological ink" and to print the 3D Technology, make tissue engineering model, observe the cell growth state and multidirectional differentiation ability. Hope to find new tissue engineering materials. Study method 1. isolation, culture of original Ad-MSCs, generation to P2, P3 for follow-up experiment; use flow cytometry to identify cell immunophenotype and software analysis; The morphology of cell microfilament was observed by PHA, and the cells were divided into endothelium, bone and fat induced differentiation, and three kinds of polypeptides (RADA16-I, RGD, KLT) were dissolved in 10% sucrose deionized solution (RGD, KLT). The mixed solution was observed by the mixture of the required concentration and volume ratio and the atomic force microscope (Olympus company), and the mixed solution was put into Transwell. The glue was observed by scanning electron microscope. The three kinds of peptides were mixed with cells and cultured, and the morphology and growth state of the cells in the polypeptide were observed and the.3. was self-assembled. The Ad-MSCs mixed solution was used as "biological ink" to print the tissue engineering model using 3D biologic printing technology. Color and observation; induced Ad-MSCs osteogenesis and lipid differentiation in the 3D model. After the induction, alizarin red S and oil red 0 were stained respectively. The results were compared with those in the contrast group. The results of the 1. inverted phase contrast microscope showed that Ad-MSCs was spindle shape, and the overall trend was swirling growth trend. Flow cytometry identified the visible separation and culture of cell CD16. 6, CD90, CD29 were positive, and did not express CD31, CD34, CD45 and HLA-DR, which conformed to the immunophenotype of Ad-MSCs. The peptide hydrogels were colorless and transparent and rich in water content; the hydrogels were observed by scanning electron microscopy, and the structure and pore of nanofibers in the gel were observed. The cells and hydrogels were mixed into glue and cultured to observe that the cells arranged closely and the growth state of.3. was printed out of the tissue engineering model using "biological ink". The cell growth was visible after the slice staining. The Ad-MSCs in the model was induced and differentiated, and the experimental group and the control group were stained, and the alizarin red S staining showed the formation of calcium nodules in the experimental group of osteogenesis induced, the oil red 0 staining showed that the lipid droplet in the lipid induced experimental group was stained in Ad-MSCs, and the two control group did not stain. Adipose tissue derived mesenchymal stem cells (MSCs) mixed solution was printed in the "biological ink" 3D tissue engineering model, Ad-MSCs grew well, and still had strong differentiation ability.
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08;TP391.73

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