本文選題：龍膽苦苷 + 人工抗原��； 參考：《陜西科技大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：龍膽苦苷(GTP)是藥用植物秦艽中的主要有效成分,也是測定其品質(zhì)的質(zhì)量控制指標(biāo)成分。龍膽苦苷具有保肝利膽、鎮(zhèn)痛、健胃、降壓、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。隨著對龍膽苦苷藥理作用研究的深入,需求量不斷上升,致使野生秦艽資源保有量急劇下降,現(xiàn)已被列為國家三級瀕危保護(hù)藥材,在利益驅(qū)使下假冒偽劣秦艽藥材在市場上隨之出現(xiàn)。因此,建立一個(gè)低成本、高效率的龍膽苦苷檢測技術(shù)尤為重要。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)作為小分子化合物檢測分析中的一種新興技術(shù),在中藥有效成分的檢測分析中備受關(guān)注。與傳統(tǒng)的檢測方法相對比,ELISA方法具有特異性強(qiáng),靈敏度高,操作便捷,樣品前處理工藝簡單,無需使用精密儀器,對操作人員技能要求不高等特點(diǎn),所以,非常適用于基層快速檢測。具體研究結(jié)果如下:(1)利用琥珀酸酐法對龍膽苦苷進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾,其目的是為了引入能與載體蛋白直接進(jìn)行偶聯(lián)的活性基團(tuán)——羧基。薄層色譜法(TLC)鑒定結(jié)果表明修飾后確有一種新物質(zhì)生成,且純度較高;質(zhì)譜技術(shù)(MS)鑒定結(jié)果顯示修飾后產(chǎn)物的分子量與理論值相符,這表明已成功獲得了羧基化的龍膽苦苷。(2)利用混合酸酐法將羧基化的龍膽苦苷與牛血清白蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)成功偶聯(lián),獲得了龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA。組合利用TLC法、紅外光譜法(IR)、紫外-可見分光光度計(jì)法(UV)、聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)和三硝基苯磺酸法(TNBS)進(jìn)行分析鑒定,結(jié)果均表明已成功獲得了龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA,并且以TNBS法測得龍膽苦苷人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA的結(jié)合比分別是9:1和6:1。(3)以人工抗原GTP-BSA和GTP-OVA為免疫原進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn),并以新西蘭大白兔為免疫對象,分別以基礎(chǔ)飼料和谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料進(jìn)行喂飼,結(jié)果顯示谷胱甘肽抗應(yīng)激飼料組的大白兔在體重、精神狀態(tài)、活動(dòng)狀態(tài)、皮毛色澤和食欲狀況等指標(biāo)均優(yōu)于基礎(chǔ)飼料組,表明谷胱甘肽可有效緩解免疫動(dòng)物在免疫過程中所產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng),為動(dòng)物免疫提供了新思路。(4)建立并優(yōu)化了間接GTP-ELISA法,結(jié)果顯示:最適包被液是碳酸鹽緩沖液,最適封閉液是山羊血清,最適抗體稀釋液是PBS+0.5%BSA,包被抗原的最適工作濃度是1:2000,酶標(biāo)二抗的最適工作濃度是1:3000。利用間接GTP-ELISA測得各實(shí)驗(yàn)組的免疫血清效價(jià)均達(dá)到了1:12800以上,且以GTP-BSA為免疫抗原所產(chǎn)生的免疫血清效價(jià)明顯高于以GTP-OVA為免疫抗原所產(chǎn)生的免疫血清效價(jià)。(5)建立并優(yōu)化了間接競爭GTP-ELISA法,結(jié)果顯示:最適競爭反應(yīng)時(shí)間是40min,最適有機(jī)溶劑是10%的甲醇溶液,洗滌液的最適pH值是7.5。利用間接競爭GTP-ELISA法對其靈敏度(IC50)和特異性進(jìn)行檢測,并計(jì)算出與5種龍膽苦苷結(jié)構(gòu)相似物的交叉反應(yīng)率。結(jié)果顯示:IC50分別是95.2ng/mL、38.9ng/mL、41.5ng/mL和10.9ng/mL;競爭抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程分別為y=18.666x-22.452(R~2=0.9722),y=19.07x-18.3315(R~2=0.9658),y=16.872x-12.188(R~2=0.9714)和y=15.523x-1.4934(R~2=0.9688)。4個(gè)實(shí)驗(yàn)組與龍膽苦苷的交叉反應(yīng)率均為100%,對獐牙菜苷和獐牙菜苦苷的交叉反應(yīng)率均0.5%,對梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷的交叉反應(yīng)率均0.1%,這表明4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的特異性均良好,尤其是對梔子苷、馬錢苷和橄欖苦苷基本沒有交叉反應(yīng)。
[Abstract]:In this paper , it has been widely used in the detection and analysis of the effective components of traditional Chinese medicine . The result shows that the method has the advantages of strong specificity , high sensitivity , convenient operation , simple pretreatment process , high purity and high efficiency . The results showed that the optimal pH value was 1 鈭，

本文編號：1909549