本文選題：HCC + S100A8��； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的研究S100A8基因特異性位點甲基化在人原發(fā)性肝細胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)中的表達情況,并在細胞水平、動物水平觀察S100A8對HCC增殖、遷移、侵襲及裸鼠成瘤能力的影響,從而為進一步了解S100A8對HCC細胞生物學(xué)行為的影響并為探討其作用機制、尋找HCC診斷及預(yù)后的新靶點奠定基礎(chǔ)。方法1.利用公共數(shù)據(jù)庫Gene Expression Omnibus(GEO)及The Cancer Genome Atlas,(TCGA,https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/)進行檢索,根據(jù)檢索詞及嚴格的數(shù)據(jù)納入、排除標準,進行薈萃分析。2.采用TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格篩選后將其甲基化程度分組后進行生存分析(Kaplan Meier法)。3.收集臨床樣本,利用焦磷酸測序技術(shù)驗證原發(fā)性肝細胞癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織中cg20070090位點的甲基化水平,并通過受試者工作特征曲線(Receiver operating characteristic curve,ROC curve)探索cg20070090位點在肝細胞癌診斷中的臨床價值。4.構(gòu)建S100A8慢病毒表達載體,通過人胚源腎細胞293T及慢病毒包裝系統(tǒng)合成病毒液,經(jīng)過病毒濃縮和滴度檢測,選取最適量病毒液侵染目的肝癌細胞Huh7、MHCC-97H(以下簡寫97H)和Hep G2。5.形成穩(wěn)定細胞系后,通過Real time-q PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot,WB)分別檢測S100A8m RNA與蛋白的表達。6.細胞功能實驗,體外探討S100A8對肝癌細胞增殖、遷移、侵襲、凋亡的影響。7.裸鼠皮下成瘤實驗,在體內(nèi)研究S100A8對肝癌細胞致病的影響。結(jié)果1.課題組兩名以上成員對公共數(shù)據(jù)庫(GEO、TCGA)的甲基化芯片數(shù)據(jù)進行檢索;嚴格按照納入、排除標準選取符合的研究;最終有5個數(shù)據(jù)集被納入本研究。薈萃分析結(jié)果提示,S100A8甲基化程度與HCC的發(fā)生率有關(guān)聯(lián)(SMD=-2.08,95%CI:-2.54--1.62)。發(fā)表偏倚分析中P0.05,提示沒有明顯的發(fā)表偏倚,結(jié)論可信度較高。并經(jīng)過敏感性分析剔除每個研究后,重復(fù)進行薈萃分析,結(jié)果并未發(fā)生改變,提示本次研究薈萃分析的結(jié)果具有高度穩(wěn)定性。2.TCGA數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴格篩選后,最終選取了345名肝癌患者數(shù)據(jù)進行生存分析(Kaplan Meier);結(jié)果顯示,在4組甲基化水平分組比較中,總生存期(Overall survival,OS)和無進展生存期(Progression-free survival,PFS)均有明顯的差異。(Estimate Median OS:Q1:2.753;Q2:4.274;Q3:5.074;Q4:8.926,log-rank p0.05.Estimate Median PFS:Q1:2.266;Q2:3.096;Q3:3.981;Q4:8.926.log-rank,p0.05)。低甲基化組(Q1)的OS和PFS明顯短于高甲基化組(Estimate Median OS time:Q1:2.753;Q2-4:4.907,log-rank p0.05.Estimate Median PFS time Q1:2.266;Q2-4:3.367,log-rank p0.05)。3.焦磷酸測序部分,配對t檢驗結(jié)果顯示癌組織的平均甲基化水平為(32.93%±14.82%);癌旁組織平均甲基化水平為(64.91%±4.65%);ROC曲線下面積(AUC)為0.950(P0.01),最佳截斷值為54.025%,敏感度為86.53%,特異性為98.07%。結(jié)果表明此實驗方法的結(jié)果準確性較高。4.本研究成功包裝合成了S100A8過表達及沉默的慢病毒液;經(jīng)過慢病毒液的濃縮及滴度檢測,篩選出合適量的病毒液,并用于侵染目的肝癌細胞株Huh7、MHCC-97H和Hep G2;形成穩(wěn)定細胞系,為下一步功能實驗提供研究對象。5.穩(wěn)定細胞系Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8經(jīng)過抗生素穩(wěn)定篩選成功,Hep G2-S100A8篩選失敗。Western blot及Real time-q PCR驗證結(jié)果顯示Huh7-S100A8、97H-S100A8蛋白及m RNA表達量均高于空載對照組(Control)。6.在肝癌細胞中轉(zhuǎn)染S100A8過表達載體后,Huh7-S100A8、MHCC-97H-S100A8增值能力均高于對應(yīng)的Control組(p0.05);遷移、侵襲能力也明顯高于Control組;而流式細胞凋亡檢測則無很明顯的趨勢。7.裸鼠皮下成瘤實驗部分,Huh7-S100A8、97H-S100A8組的鼠瘤體積、重量均大于Control組。(p0.05)結(jié)論1.通過公共數(shù)據(jù)庫薈萃分析顯示S100A8特異性位點低甲基化水平與HCC發(fā)生呈正相關(guān)。偏倚分析、敏感性分析等提示本次研究薈萃分析的結(jié)果具有高度穩(wěn)定性。2.生存分析顯示,低甲基化組的OS和PFS明顯低于高甲基化組,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。3.焦磷酸測序技術(shù)驗證原發(fā)性肝細胞癌組織與其對應(yīng)的癌旁組織中cg20070090位點的甲基化水平,顯示癌組織的平均甲基化水(32.93%±14.82%)顯著低于癌旁組織平均甲基化水平(64.91%±4.65%);4.成功構(gòu)建了過表達S100A8基因的肝癌細胞系Huh7-S100A8、97H-S100A8。5.利用穩(wěn)定細胞系Huh7-S100A8、97H-S100A8初步分析了其生物學(xué)功能,S100A8的上調(diào)促進肝腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移與侵襲。6.成功完成裸鼠皮下種瘤實驗,認為S100A8的上調(diào)可促進裸鼠肝皮下瘤的生長。
[Abstract]:鐩殑鐮旂┒S100A8鍩哄洜鐗瑰紓鎬т綅鐐圭敳鍩哄寲鍦ㄤ漢鍘熷彂鎬ц倽緇嗚優(yōu)鐧，

本文編號：1888967