本文選題：阿爾茨海默癥 + 神經(jīng)再生��； 參考：《深圳大學》2017年碩士論文

【摘要】：目的:阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是常見于老年期的一種神經(jīng)退行性疾病。大腦中的β淀粉樣蛋白(amyloid myloid,Aβ)聚集形成的斑塊沉積和過度磷酸化Tau蛋白聚集導致的神經(jīng)纖維纏結被公認為是AD的主要病理特征。對于AD來說,維持神經(jīng)系統(tǒng)的完整性以及神經(jīng)元正常功能是治療的最終目的。神經(jīng)再生在維持腦認知及神經(jīng)功能方面具有重要作用,并且神經(jīng)再生缺陷是導致AD認知障礙的重要因素。目前,靶向誘導神經(jīng)干細胞(Neural stem cell,NSC)的再生被認為是治療AD的有效策略之一。硒代蛋氨酸(Selenomethionine,Se-Met)是動物體攝入有機硒的主要形式,我們的前期研究發(fā)現(xiàn)硒代蛋氨酸能夠改善三轉基因(Psenl、APPSwe、tauP301L)(3×Tg)AD小鼠的認知障礙,逆轉突觸損傷。本實驗采用3×Tg AD小鼠從體內(nèi)探索Se-Met對成年3×TgAD小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)NSCs再生分化以及對神經(jīng)系統(tǒng)的修復作用;同時分離3×Tg原代NSCs,體外實驗探究Se-Met對NSCs增殖分化的影響及相關分子機制,為特異性治療AD的藥物研究提供科學依據(jù)。方法:1)體外實驗:分離培養(yǎng)新生3×TgAD鼠海馬原代NSCs,流式細胞儀分選CD133+ CD24+的NSCs,細胞活力檢測試劑盒篩選Se-Met作用的最佳濃度及時間,免疫熒光及形態(tài)學檢測Se-Met對NSCs增殖的影響,同時Western-blot 法檢測以下蛋白水平的變化:PI3K,Akt,GSK3β,β-catenin,Cyclin-D等。10βM Se-Met持續(xù)作用三周之后,通過免疫熒光檢測NSCs向神經(jīng)元(MAP2+)和星型膠質細胞(GFAP+)的分化,以及形態(tài)學分析觀察分化后的神經(jīng)元形態(tài)及特征。2)體內(nèi)實驗:Se-Met以6μg/mL濃度溶解于4月齡3×Tg AD小鼠的飲用水中,持續(xù)給藥三個月后,采用免疫熒光檢測3×Tg AD小鼠腦內(nèi)海馬區(qū)NSC(Nestin+)、新生神經(jīng)元(BrdU+NeuN+)數(shù)量的變化,以及未成熟神經(jīng)元(DCX+)和成熟神經(jīng)元(NeuN+)形態(tài),數(shù)量,密度及分布變化。Western-blot法檢測相關信號通路蛋白水平的變化:PI3K,Akt,GSK3β,β-catenin,Cyclin-D 等。結果:1)體外實驗:我們首先從新生3×TgAD小鼠海馬區(qū)分離NSC,經(jīng)過流式細胞儀分離出CD24+和CD133+雙陽性的NSC行培養(yǎng)。CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)低濃度(1,5,10μM)的Se-Met能夠促進NSCs的增殖,而高濃度的(50,100μM)Se-Met則抑制NSCs的增殖。BrdU免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn),10μM Se-Met處理48h之后NSCs數(shù)量明顯增加。通過形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn),Se-Met組作用之后NSCs形成神經(jīng)球的速度和成球的大小均顯著增加(**p＜0.01)。在機制研究方面,我們發(fā)現(xiàn)Se-Met能夠顯著提高Wnt信號通路中的關鍵激酶β-catenin的活性(*p＜0.05);并且顯著促進其下游Cyclin-D的表達(*p＜0.05)。此外Se-Met組中PI3K和Akt的蛋白表達水平均顯著增加(**p＜0.01,*p＜0.05)。10μM Se-Met 持續(xù)作用三周之后,形態(tài)學觀察分析結果顯示,NSC 大多分化為神經(jīng)元;通過免疫熒光檢測MAP2+標記的神經(jīng)元發(fā)現(xiàn),Se-Met組中的神經(jīng)元數(shù)量,樹突棘密度和大小都有明顯的增加,另外,Se-Met作用后,原漿型星形膠質細胞數(shù)量有明顯上升,纖維型星形膠質細胞數(shù)量有減少;免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn),Se-Met組中神經(jīng)元蛋白NeuN水平顯著上升,星形膠質蛋白GFAP水平顯著下降(*p0.05,*p＜0.05)。2)體內(nèi)實驗:Se-Met(6μg/mL)治療 90 天后,免疫熒光發(fā)現(xiàn),七月齡AD小鼠海馬區(qū)Nestin+標記的NSCs數(shù)量、NeuN+標記的成熟神經(jīng)元數(shù)量和DCX+標記的未成熟神經(jīng)元密度都有明顯上升,GFAP+星形膠質細胞的數(shù)量有所下降;同時BrdU+新生神經(jīng)元的數(shù)量有一定上升;免疫印跡檢測相關蛋白激酶蛋白水平發(fā)現(xiàn),β-catenin的活性顯著上升(*p0.05),Cyclin-D的水平有上升趨勢,GSK3β的活性顯著下降(*p＜0.05),PI3K及Akt的活性均顯著增加(**p＜0.01,**p＜0.01)。結論:Se-Met能夠通過激活PI3K/Akt/Wnt/β-catenin信號通路促進成年小鼠腦內(nèi)NSCs的再生,并且能夠促進NSCs向神經(jīng)元分化,從而填補受損的神經(jīng)系統(tǒng),改善3×TgAD小鼠的認知和記憶能力,這是首次證實硒類化合物對于神經(jīng)再生促進和調控作用,為Se-Met對AD治療效應提出腦修復相關機制。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：深圳大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R749.16

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