本文選題：桂皮醛　切入點(diǎn)：非小細(xì)胞肺癌　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究目的:桂皮醛(Cinnamaldehyde,CA),是中藥肉桂揮發(fā)油中的一種主要提取物。本課題組前期體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):CA對多株腫瘤細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡和抑制侵襲轉(zhuǎn)移的功效,而其中的作用機(jī)制尚未明確闡明。此外,結(jié)合理論和前期研究我們發(fā)現(xiàn),上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化可能是腫瘤發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制之一。因此本課題組擬研究桂皮醛對人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響,進(jìn)一步探討CA抑制非小細(xì)胞肺癌的可能機(jī)制,為中醫(yī)藥治療肺癌提供新的理論依據(jù)。研究方法:1采用MTT法,觀察CA對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299的增殖抑制作用。2采用流式細(xì)胞術(shù)(Flowcytometry,FCM)和Hoechst 33258染色實(shí)驗(yàn),研究CA對A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞凋亡比例和染色質(zhì)形態(tài)的影響。3采用CoCl2構(gòu)建缺氧模型,倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。4采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的變化。5采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力的變化。6 采用 RT-qPCR 法檢測 CA 對 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細(xì)胞中凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移及Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因表達(dá)的影響。7 采用 Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測 CA 對 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細(xì)胞中凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移及Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá)的影響。8采用免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測CA對A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞中β-catenin胞漿聚集及核轉(zhuǎn)位表達(dá)的影響。9采用人肺腺癌細(xì)胞A549建立裸鼠皮下移植瘤模型,腹腔注射給藥,測量并計(jì)算CA對移植瘤體積和質(zhì)量的抑制率。10采用RT-qPCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)方法檢測移植瘤組織中Wnt/β-catenin通路活性及凋亡、EMT、侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白的變化。研究結(jié)果:1 MTT實(shí)驗(yàn)提示,CA能有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖,并呈現(xiàn)劑量、時(shí)間依賴性。2流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示CA能誘導(dǎo)A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞凋亡且與濃度呈正相關(guān)。Hoechst33258熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察到CA使得細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮及碎裂。3 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CA 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細(xì)胞后,Bcl-2、Bcl-xl基因表達(dá)下降,Bax基因表達(dá)上升。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CA作用于A549細(xì)胞后,Bcl-2、Bcl-xl、Caspase-3、PARP 蛋白表達(dá)下降,Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved PARP蛋白表達(dá)上升。4 CoCl2作用于A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞后,細(xì)胞呈現(xiàn)出紡錘狀間質(zhì)形態(tài)。劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測出CoCl2誘導(dǎo)的缺氧環(huán)境可顯著增強(qiáng)細(xì)胞的遷移、侵襲能力。5 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CoCl2 作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細(xì)胞后,N-cadherin、Vimentin、Snail、Twist、MMP-2、MMP-9、MMP-14 基因表達(dá)上升,E-cadherin基因表達(dá)下降。Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CoCl2作用于細(xì)胞后,HIF-1α、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)增強(qiáng),E-cadherin 蛋白表達(dá)減弱。6 CA作用于CoCl2誘導(dǎo)的A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞后,劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CA能夠有效降低CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移、侵襲能力。RT-qPCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CA顯著抑制了 CoCl2誘導(dǎo)的細(xì)胞MMPs表達(dá)及EMT。7 RT-qPCR 及 Western blotting 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CoCl2 能夠顯著增強(qiáng) A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞中β-catenin、Cyclin-D1表達(dá)并促進(jìn)β-catenin核聚集,而CA能有效地抑制Wnt/β-catenin通路相關(guān)基因活性。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示CoCl2誘導(dǎo)了β-catenin的胞漿聚集與核轉(zhuǎn)移,而該促進(jìn)作用可被CA有效抑制。8 特異性激動(dòng)劑LiCl作用于 A549,YTMLC-90,NCI-H1299 細(xì)胞后,Wnt/β-catenin通路活性隨之被激活,同時(shí)細(xì)胞遷移、侵襲能力增強(qiáng),且Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)Wnt/β-catenin通路的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT。相反,特異性抑制劑XAV939作用于CoCl2誘導(dǎo)的A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞后,Wnt/β-catenin通路活性降低的同時(shí),細(xì)胞遷移、侵襲能力減弱,細(xì)胞EMT被逆轉(zhuǎn)。此外,Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,CA能逆轉(zhuǎn)A549,YTMLC-90,NCI-H1299細(xì)胞EMT且效力較XAV939相似,而LiCl在激活了Wnt/β-catenin通路的同時(shí),能夠部分逆轉(zhuǎn)CA對細(xì)胞EMT的抑制作用。9體內(nèi)裸鼠移植瘤模型中,CA應(yīng)用后腫瘤的瘤體積較空白組明顯減小,腫瘤的質(zhì)量與空白組比較也有所下降,低、高劑量組的腫瘤生長均受到抑制。10 RT-qPCR及Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí),裸鼠移植瘤經(jīng)CA腹腔注射后,腫瘤組織中促凋亡基因表達(dá)上調(diào),抑凋亡基因表達(dá)下調(diào);間質(zhì)樣分子表達(dá)被抑制;Wnt/β-catenin活性亦減弱,且均呈明顯的劑量依賴性。免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果顯示,隨著CA濃度提高,腫瘤組織中Cleaved PARP、E-cadherin表達(dá)遞增,β-catenin表達(dá)則隨之遞減。研究結(jié)論:1桂皮醛能有效抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549,YTMLC-90,NCI-H1299增殖并通過增加Bax/Bcl-2比例、活化Caspase-3、PARP誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。2桂皮醛能抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進(jìn)而起到抗侵襲轉(zhuǎn)移的功效。3桂皮醛能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路,逆轉(zhuǎn)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R273

【參考文獻(xiàn)】

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2 彭仁通;;溫陽法聯(lián)合TP方案治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床研究[J];中醫(yī)學(xué)報(bào);2016年02期

3 王珊珊;郭茗;朱W，

本文編號(hào)：1689034