本文關(guān)鍵詞： 川芎嗪(TMP) 肝纖維化 肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC) 血管生成 Hedgehog信號(hào)通路　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[背景]肝纖維化是多種慢性肝病,如:酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪肝的共同病理過程,對(duì)肝纖維化進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷與治療一直是困擾醫(yī)學(xué)界的重大難題。新近研究表明,肝纖維化過程中伴隨有病理性血管生成及肝竇毛細(xì)血管化現(xiàn)象,這對(duì)于肝纖維化的診斷、治療以及預(yù)后具有重要意義。因此,調(diào)控肝纖維化過程中肝竇毛細(xì)血管化及肝血竇內(nèi)環(huán)境有望成為防治肝纖維化的潛在策略。本課題組近年來對(duì)天然產(chǎn)物川考嗪(tetramethylpyrazine,TMP)的抗肝纖維化作用與分子機(jī)理進(jìn)行了較為深入的研究,發(fā)現(xiàn)其可以抑制肝星狀細(xì)胞(HSC)的增殖、活化,促進(jìn)HSC凋亡。鑒于以上發(fā)現(xiàn),我們提出TMP可能通過改善病理性血管生成發(fā)揮抗肝纖維化作用的假說。本論文對(duì)此進(jìn)行了深入的研究。[方法]本論文首先從體內(nèi)角度研究了 TMP對(duì)肝纖維化過程中血管生成的改善作用。通過腹腔注射四氯化碳(CCl4,40%)的方法建立大鼠肝纖維化模型,預(yù)防給予TMP(100mg/kg)處理。組織學(xué)檢測(cè)各組大鼠肝臟病理變化;掃描電鏡(SEM)觀察肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)窗孔結(jié)構(gòu);ELISA檢測(cè)不同組別大鼠肝組織勻漿及血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)、血小板衍生生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)的表達(dá)水平;Real time-PCR、Western blotting及免疫熒光檢測(cè)肝組織中VEGF-R2、PDGF-βR、Smo和Gli1等的mRNA和蛋白表達(dá)水平。其次,我們應(yīng)用VEGF-A構(gòu)建原代小鼠LSEC促血管生成模型;采用Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TMP對(duì)VEGF-A誘導(dǎo)的LSEC促血管生成能力的影響;ELISA檢測(cè)TMP對(duì)VEGF-A誘導(dǎo)的LSEC細(xì)胞上清中PDGF-BB及Shh表達(dá)水平的影響;Real time-PCR、Western blotting及免疫熒光檢測(cè)TMP對(duì)促血管生成分子:VEGF-R2、PDGF-βR與HIF-1α等及Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)分子Patched1(Ptcl)、Smoothened(Smo)和Gli1等表達(dá)的影響。最后,我們通過小鼠尾靜脈注射Smo過表達(dá)質(zhì)粒,進(jìn)一步明確TMP抗肝纖維化藥理效應(yīng)。[結(jié)果]體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TMP能夠顯著緩解CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織損傷、抑制膠原纖維的產(chǎn)生與沉積,進(jìn)而改善肝纖維化。TMP通過維持和上調(diào)LSEC窗孔的數(shù)量、下調(diào)LSEC毛細(xì)血管化水平及促血管生成相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá),顯示對(duì)肝纖維化過程中病理性血管生成的阻斷作用。體外實(shí)驗(yàn)表明,TMP能夠劑量依賴性抑制LSEC的促血管生成行為。Matrigel小管形成實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn),TMP能夠明顯減少LSEC形成的小管數(shù)目及長(zhǎng)度。因此,本研究表明,TMP能夠通過抑制病理性血管生成從而改善化學(xué)誘導(dǎo)的肝纖維化,并且TMP的這一作用可能是通過調(diào)控LSEC表型實(shí)現(xiàn)的。本文接下來將對(duì)LSEC促血管生成行為的分子機(jī)理進(jìn)行深入研究�，F(xiàn)已明確,LSEC作為肝臟特有的血管內(nèi)皮細(xì)胞,受多種促血管生成細(xì)胞因子的調(diào)控,其中血小板內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(PDGF)、血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)等在分化型LSEC轉(zhuǎn)化為毛細(xì)血管化型LSEC,進(jìn)而發(fā)揮促血管生成作用方面扮演重要角色。因此,本論文探討TMP對(duì)LSEC促血管生成行為的分子機(jī)理進(jìn)行了深入研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,TMP通過阻斷Hedgehog信號(hào)通路活性抑制毛細(xì)血管化型LSEC的促血管生成作用。TMP主要通過減少肝纖維化過程中Hedgehog信號(hào)通路配體Shh的含量,抑制Hedgehog信號(hào)通路關(guān)鍵膜受體蛋白Ptcl與Smo的表達(dá),并抑制Gli1的激活、入核,阻斷Glil與促血管生成靶基因的順式作用原件結(jié)合,進(jìn)而下調(diào)促血管生成相關(guān)靶基因的表達(dá)。此外,我們進(jìn)一步使用Hedgehog信號(hào)通路特異性抑制劑環(huán)杷明(Cyc)、激動(dòng)劑SAG考察TMP調(diào)控Hedgehog信號(hào)通路與抑制LSEC促血管生成的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Cyc可發(fā)揮與TMP相似的抑制LSEC促血管生成作用,而SAG則可以逆轉(zhuǎn)TMP的這一作用。實(shí)驗(yàn)研究表明,TMP可以通過抑制Hedgehog信號(hào)通路的活性阻斷LSEC促血管生成行為。[結(jié)論]本論文通過實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)LSEC促進(jìn)病理性血管生成行為的分子機(jī)理與分子靶標(biāo),有助于揭示LSEC表型改變(即由分化型轉(zhuǎn)變?yōu)槊?xì)血管化型)在肝纖維化病理性血管生成中所發(fā)揮的重要作用。在此基礎(chǔ)上明確了 TMP抑制肝纖維化過程中肝竇血管生成的分子機(jī)制,為靶向Hedgehog通路的抗肝纖維化新藥研發(fā)提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:In this paper , we studied the effects of TMP on hepatic fibrosis by improving pathological angiogenesis and the expression of VEGF - R2 , PDGF - 尾R , Smo and Gli1 . The results of experiments show that TMP can inhibit the angiogenesis of LSEC by inhibiting the activity of Hedgehog signaling pathway . The results show that TMP can inhibit the angiogenesis of LSEC by inhibiting the activity of Hedgehog signaling pathway .

【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5

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6 丁s，

本文編號(hào)：1534769