本文關(guān)鍵詞： miR-128 心肌缺血再灌注損傷 Nrf2 氧化損傷 H_2O_2　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:心肌梗死是導(dǎo)致冠心病患者死亡的主要原因。目前,溶栓治療或早期介入手段為缺血部位恢復(fù)血液灌流,可以有效改善心肌缺血或者壞死。但是,心肌長時間缺血再重新灌流后,會導(dǎo)致部分心肌細胞死亡和心臟功能的損失,即缺血再灌注損傷。MicroRNA(miRNA,miR)是一類小的非編碼RNA分子。近年來的研究表明,miRNA在心肌缺血再灌注損傷中的作用日益重要。轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2(Nuclear factor erythroid2-related factor 2,Nrf2)-抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)是一種十分重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路。在心肌細胞中,Nrf2蛋白的表達增加,可以有效減輕心肌細胞損害,從而顯著改善心臟功能。本研究主要集中于分析miR-128在預(yù)防心肌缺血再灌注損傷中的重要作用。通過探討miR-128在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制,為治療缺血性心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的損害和改善心臟功能提供新的治療策略方法:1.收集40例急性心肌缺血以及30例健康對照患者,從肘靜脈采集研究對象外周血中miR-128表達水平。2.構(gòu)建大鼠心肌缺血模型。用免疫組化和實時定量PCR方法檢測miR-128和Nrf2的m RNA水平。3.雙熒光素酶報告基因檢測Nrf2是否是miR-128的靶基因。4.分別構(gòu)建高表達和低表達miR-128的腺病毒載體,并將其注射入大鼠心肌組織內(nèi)。收集心肌組織,檢測ROS水平、細胞凋亡情況、心臟功能改善情況(+dp/dtmax、LVSP、LVEDP)。Hoechst染色法、流式細胞術(shù)及TUNEL染色法檢測大鼠心肌細胞的凋亡情況。5.透射電鏡觀察線粒體損傷情況。結(jié)果:1.在急性心肌缺血患者血清中miR-128表達水平升高。2.在缺血再灌注損傷的大鼠模型中,miR-128的表達水平增加,Nrf2的表達降低。3.體外研究H2O2刺激會顯著誘導(dǎo)miR-128水平升高。通過生物信息學的分析發(fā)現(xiàn),在Nrf2的3’UTR區(qū)有一個保守的結(jié)合位點。雙熒光素酶報告基因分析的結(jié)果表明,miR-128可以有效抑制熒光素酶的活力。4.體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),過表達miR-128可以有效抑制Nrf2的表達,而抑制miR-128的水平可以增加心肌細胞中Nrf2的表達情況。伴隨著心肌細胞中Nrf2表達水平的升高,其下游基因HO1、NQO1、SOD1水平升高。在大鼠心肌組織中抑制miR-128后,抗氧化相關(guān)酶的表達水平隨之升高,而心肌組織中ROS水平明顯下調(diào)。同時,抑制miR-128可以有效降低心肌細胞的凋亡并改善缺血再灌注損傷后的心肌功能。5.透射電鏡分析發(fā)現(xiàn),與正常對照相比,缺血/再灌注損傷組中,心肌組織中線粒體嚴重腫脹、呈現(xiàn)空泡狀、心肌細胞的內(nèi)外膜結(jié)構(gòu)不完整。與之相反,在心肌組織中抑制miR-128以后,心肌細胞中線粒體腫脹的現(xiàn)象明顯得到緩解。結(jié)論:1.心肌缺血的患者血清中miR-128表達水平升高。2.H_2O_2誘導(dǎo)原代心肌細胞miR-128表達水平的升高。miR-128通過調(diào)控Nrf2影響細胞凋亡。3.心肌缺血再灌注損傷模型中miR-128表達水平的升高,抑制miR-128影響ROS水平,減少心肌組織凋亡細胞數(shù),從而影響心肌損傷。
[Abstract]:Objective: myocardial infarction is the leading cause of death in patients with coronary heart disease. At present, thrombolytic therapy or early intervention to restore blood perfusion at the ischemic site can effectively improve myocardial ischemia or necrosis. Myocardial ischemia and reperfusion for a long period of time will lead to the death of some myocardial cells and the loss of cardiac function. Ischemia-reperfusion injury. MicroRNA-miRNA-miRis is a class of small non-coding RNA molecules. Recent studies have shown that miRNAs play an increasingly important role in myocardial ischemia-reperfusion injury. Transcription factor NF-E2 related factor 2Nuclear factor erythroid2-related factor 2nrf2nrf2nr-antioxidant response element. The expression of nrf2 protein is increased in cardiomyocytes, which is a very important endogenous antioxidant stress pathway. This study mainly focuses on the analysis of the important role of miR-128 in preventing myocardial ischemia-reperfusion injury. By exploring the role and mechanism of miR-128 in myocardial ischemia-reperfusion injury, To provide a new therapeutic strategy for the treatment of ischemic myocardial ultrastructure damage and improve cardiac function, we collected 40 patients with acute myocardial ischemia and 30 healthy controls. The expression level of miR-128 in peripheral blood of subjects collected from cubital vein was .2.The myocardial ischemia model of rats was established. The m RNA level of miR-128 and Nrf2 was detected by immunohistochemistry and real-time quantitative PCR. The expression of Nrf2 was detected by double luciferase report gene. The target gene of miR-128. 4. Construct the adenovirus vector with high expression and low expression of miR-128, respectively. The myocardial tissue was collected, the level of ROS, apoptosis and the improvement of cardiac function were detected (dp / dtmax-LVSPP LVEDPN. Hoechst staining). Flow cytometry and TUNEL staining were used to detect apoptosis of rat cardiomyocytes. 5. Transmission electron microscopy was used to observe mitochondrial damage. Results: 1. The expression of miR-128 in serum of patients with acute myocardial ischemia was increased. The expression level of miR-128 increased and the expression of nrf2 decreased in rat model. In vitro, H2O2 stimulation could significantly increase the level of miR-128. There is a conserved binding site in the 3UTR region of Nrf2. The results of double luciferase reporter gene analysis showed that mmiR-128 could effectively inhibit the activity of luciferase. It was found that overexpression of miR-128 could effectively inhibit the expression of Nrf2 in vivo. Inhibition of miR-128 level could increase the expression of Nrf2 in cardiac myocytes. With the increase of Nrf2 expression level in cardiomyocytes, the downstream gene HO1NQO1SOD1 increased. At the same time, inhibition of miR-128 could effectively reduce the apoptosis of myocardial cells and improve myocardial function after ischemia-reperfusion injury. In the ischemia / reperfusion injury group, the mitochondria were swollen, vacuolated and the inner and outer membrane structure of the myocardial cells were incomplete. On the contrary, after inhibition of miR-128 in the myocardial tissue, the mitochondria in the ischemic / reperfusion injury group were seriously swollen and vacuolated, and the inner and outer membrane structures of the myocardial cells were incomplete. Conclusion: 1. The expression of miR-128 in serum of patients with myocardial ischemia was significantly alleviated. 2. H _ 2O _ 2 induced the increase of miR-128 expression in primary cardiomyocytes. MiR-128 affected apoptosis by regulating Nrf2. The increase of miR-128 expression in myocardial ischemia-reperfusion injury model. Inhibition of miR-128 affects the level of ROS and the number of apoptotic cells in myocardial tissue, thus affecting myocardial injury.
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R54

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本文編號：1511405