本文關(guān)鍵詞： 丹參 丹參莖葉 資源化學(xué) 基因表達(dá) 活血化瘀　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：本論文共分為五章內(nèi)容。第一章文獻(xiàn)研究分別從丹參本草考證、丹參資源品種與分布、丹參中化學(xué)成分及藥理活性研究和丹參的生長及采收規(guī)律等方面綜述了丹參藥用資源的研究概況。通過對近年來丹參地上部分資源性化學(xué)成分及其藥理活性研究進(jìn)行歸納分析,并探索性提出其資源利用價值與利用途徑,以期為丹參資源的系統(tǒng)利用及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供依據(jù)和參考。基于丹參基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及代謝組學(xué)等方面近年來的研究進(jìn)展,對丹參酚酸類成分的生物合成途徑、關(guān)鍵酶基因與調(diào)控機制,以及丹參酚酸類成分生物轉(zhuǎn)化利用現(xiàn)狀等進(jìn)行歸納分析,以期為丹參酚酸類物質(zhì)資源的高效生產(chǎn)與資源綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。第二章丹參資源化學(xué)研究1、采用UPLC-TQ/MS聯(lián)用技術(shù)測定不同采收期丹參不同部位中丹酚酸類、丹參酮類、黃酮類及三萜類成分的含量,結(jié)果表明,在整個生長期內(nèi),丹參根部丹酚酸類成分含量呈"M"形的變化趨勢,在春季出苗期(4～5月)和地上部分生長旺盛期(7～8月)達(dá)到最高(6.598%),丹參酮類成分在翌年返青時含量較高,最高為0.716%。丹參地上部分資源性化學(xué)成分種類豐富且含量可觀,可作為獲取丹參酚酸類化學(xué)成分的新資源,對其適宜采收期的確定還需要根據(jù)實際需求加以評價,若以丹酚酸類成分為主要功效物質(zhì)基礎(chǔ)作為評價指標(biāo)時,應(yīng)選擇7-8月份丹參地上部分生長旺盛時為最佳采收期。2、采用HPLC-ELSD法測定不同采收期丹參不同部位(根、莖、葉和花)中糖類成分含量,主要為果糖、葡萄糖、蔗糖和水蘇糖,分析了這4種糖類成分在丹參不同部位、不同生長時期的變化規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn),丹參根中富含水蘇糖,且在冬季地上部分枯萎時含量最高(29.97%)。丹參莖中單糖(果糖和葡萄糖)分別在枯萎期及出苗期含量最高,雙糖(蔗糖)和低聚糖(水蘇糖)則在7月份地上部分生長旺盛期積累量最高。丹參葉中單糖(果糖和葡萄糖)則在春季5月份含量最高,分別為3.73%、4.62%,而雙糖(蔗糖)和低聚糖(水蘇糖)則在7月份地上部分生長旺盛期,光合作用最強時積累量最高。丹參花中單糖類化合物在5月中旬盛花期時積累量最高,其中果糖為6.91%、葡萄糖為5.20%,雙糖和低聚糖積累量達(dá)到最高時為6月中下旬末花期。3、采用UPLC色譜系統(tǒng),"中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)"(國家藥典委員會2004A版)建立對照圖譜和進(jìn)行相似度評價,SPSS 19.0進(jìn)行主成分分析和聚類分析。建立并比較了丹參、丹參莖葉中水溶性丹酚酸類成分UPLC特征指紋圖譜,同時分析評價7種丹酚酸類成分(丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和丹酚酸A)。結(jié)果表明,丹參及其莖葉水提物指紋圖譜具有一定相似性,相似度最高可達(dá)0.981,共有化學(xué)成分主要為丹酚酸類成分。定量分析表明不同批次丹參、丹參莖葉中丹酚酸類成分含量存在一定差異,但丹酚酸類成分的種類組成相一致。4、采用UPLC色譜系統(tǒng)構(gòu)建丹參莖葉的指紋圖譜,同時應(yīng)用相似度評價、聚類分析和主成分分析(PCA)對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,獲得丹參莖葉醇提物UPLC特征圖譜,共有峰13個。各批次丹參莖葉的相似度為0.823～0.997,聚類分析、PCA結(jié)果與相似度分析結(jié)果一致。丹參莖葉UPLC指紋圖譜的構(gòu)建和化學(xué)模式的識別為其質(zhì)量控制和丹參非藥用部位利用價值的挖掘提供了科學(xué)依據(jù)。第三章丹參不同生長期不同部位關(guān)鍵酶基因表達(dá)與活性成分積累相關(guān)性分析1、通過熒光定量PCR技術(shù)研究丹參不同組織中參與丹酚酸類和丹參酮類成分生物合成的關(guān)鍵酶基因在不同生長期的表達(dá)情況,包括參與丹酚酸類合成的五個關(guān)鍵酶基因(SmPAL1、Sm4CL1、SmHPPR、SmRAS和SmCYP98A14)和參與丹參酮合成的五個關(guān)鍵酶基因(SmAACT、SmDXR、SmGGPPS、SmCPS和SmKSL)。參與合成丹參根中丹酚酸類成分的關(guān)鍵酶基因,相對表達(dá)量較高的主要為SmCYP98A14、SmPAL1和Sm4CL1,其中SmCYP98A14為迷迭香酸合成下游途徑的關(guān)鍵酶,在花期(5月)和地上形態(tài)穩(wěn)定期(8月)表達(dá)量達(dá)到最高。SmPAL1在莖和花中的相對表達(dá)量在5月和8月最高,SmHPPR在莖中表達(dá)量較低,而在葉中的表達(dá)主要在地上部分生長后期(7～9月),在丹參花中,除SmHPPR在4月和5月未檢測到,各基因的表達(dá)總體呈先降后升的趨勢。丹參根中SmDXR在整個生長期表達(dá)量呈遞減趨勢,SmGGPPS主要在4～9月表達(dá)量相對較高,且在9月達(dá)到峰值。2、采用UPLC-TQ/MS技術(shù)對不同生長期丹參不同部位中各丹酚酸及丹參酮類化合物進(jìn)行動態(tài)變化研究,結(jié)合qPCR技術(shù)研究丹參根、莖、葉和花中參與丹酚酸類和丹參酮類化合物生物合成的關(guān)鍵酶基因在不同生長期的表達(dá)情況,并采用統(tǒng)計學(xué)軟件建立基因表達(dá)量和成分積累的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示,SmPAL1作為丹酚酸類成分合成途徑中苯丙氨酸支路的第1個關(guān)鍵酶基因,與丹參根中迷迭香酸含量相關(guān)性較大,相關(guān)系數(shù)r為0.430,其次為丹酚酸B和總酚酸。在丹參莖中,SmPAL1基因與原兒茶醛、咖啡酸和丹酚酸A含量顯著負(fù)相關(guān)(P0.05),丹參葉中僅SmHPPR與紫草酸的合成存在極顯著正相關(guān)(P0.01)。SmHPPR和SmCYP98A14在丹參花中與丹參素、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A及總酚酸含量皆存在負(fù)相關(guān),且與迷迭香酸和總酚酸量積累存在極顯著負(fù)相關(guān)(P0.01)。丹參根中SmDXR、SmGGPPS和SmKSL與丹參新酮的合成或積累存在正相關(guān)。第四章丹參莖葉活血化瘀效應(yīng)評價1、基于寒凝血瘀模型,以丹參莖葉和丹參水提物及醇提物為研究對象,通過觀察丹參莖葉及丹參不同部位不同劑量對血瘀大鼠血液流變學(xué)及凝血功能的影響,并采用多指標(biāo)綜合指數(shù)法和PCA法綜合評價丹參莖葉及丹參的總活血化瘀效應(yīng)。研究表明高劑量丹參醇提物活血化瘀效應(yīng)最佳,能顯著改善血瘀大鼠血液流變學(xué)和凝血功能指標(biāo),同時,丹參莖葉水提物高劑量組亦具有良好活血化瘀效應(yīng),其總活血效應(yīng)值僅次于低劑量丹參醇提物,證實了丹參莖葉活血化瘀、改善血液循環(huán)的藥理活性,具有潛在藥用價值。通過觀察丹參莖葉及丹參不同部位不同劑量對血瘀大鼠炎癥因子(TNF-α和IL~(-1)β)、內(nèi)源性活性因子(TXB2和6-keto-PGF1α)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)水平的變化,結(jié)果表明,與空白組比較,模型組大鼠TNF-α、IL~(-1)β、TXB2和iNOS水平升高,6-keto-PGF1α水平降低(P0.05,0.01),各給藥組中TNF-α、IL~(-1)β和iNOS水平均降低,且接近正常組水平。與模型組比較,各給藥組可降低TXB2的量(P0.05,0.01),升高6-keto-PGF1α的量,提示丹參莖葉和丹參發(fā)揮活血化瘀作用的機制可能為抑制炎癥因子分泌,保護血管內(nèi)皮功能變化等,為丹參莖葉作為新藥源得以開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。2、通過體外試驗,以血漿凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)、活化部分凝血活酶時間(APTT)和纖維蛋白原(FIB)為評價指標(biāo),探討7月份丹參莖葉水提物和醇提物(SY-7、CY-7)、12月份丹參莖葉水提物和醇提物(SY~(-1)2、CY~(-1)2)及丹參水提物和醇提物(SG、CG)對家兔凝血功能的影響。研究表明,丹參莖葉和丹參醇提物對家兔體外抗凝血作用強于其水提物,作用較強的指標(biāo)為TT,作用大小為CGCY-7CY~(-1)2,且與空白組比較均具有顯著性差異(P0.01)。三者均不能延長凝血酶原時間(PT),對活化部分凝血活酶時間(APTT)而言,作用大小順序為CY-7CGCY~(-1)2。對家兔體外纖維蛋白原(FIB)的影響,CGCY-7CY~(-1)2。此外,丹參莖葉醇提物(CY-7)與丹參根醇提物(CG)相比,體外抗凝血作用無顯著差異。3、以清除DPPH自由基、清除ABTS自由基和還原Fe3+能力為藥效評價指標(biāo),比較丹參7月份莖葉、12月份莖葉和丹參根的水提物及醇提物抗氧化活性大小,同時結(jié)合UPLC-TQ/MS技術(shù)對其化學(xué)組分進(jìn)行定性定量分析。研究表明,丹參地上莖葉作為丹參非傳統(tǒng)藥用部位,具有較強的體外抗氧化能力,其中7月份丹參莖葉水提物抗氧化、清除自由基能力最強,清除DPPH和ABTS自由基的EC50分別為19.14μg·mL-L~(-1)和9.24μg·mL~(-1),其富含水溶性丹酚酸類成分,以丹參素、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B為主。通過對這4種主要單體化合物進(jìn)行體外抗氧化評價,發(fā)現(xiàn)活性最強的為咖啡酸,對DPPH和ABTS自由基清除率分別為4.76μg·mL~(-1)和2.65 μg·mL~(-1)。第五章丹參莖葉對HUVECs的保護作用及其機制1、體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs),觀察丹參莖葉及丹參水提物和醇提物對過氧化氫(H202)誘導(dǎo)HUVECs損傷的保護作用,并探討其可能的作用機制。以H202(6.06 mmol.L~(-1))損傷HUVECs 2 h建立損傷模型,并設(shè)Vc為陽性對照,采用MTT法檢測丹參莖葉及丹參水提物、醇提物以及丹參中代表性丹酚酸、黃酮和丹參酮類化合物(迷迭香酸、丹酚酸B、蘆丁、異槲皮苷和隱丹參酮)對HUVECs細(xì)胞增殖率的影響,采用試劑盒檢測細(xì)胞上清液中GSH-Px、CAT、NO和ET~(-1)含量。結(jié)果顯示,丹參莖葉醇提物(CJ)、丹參醇提物(CG)、丹參莖葉水提物(SJ)和丹參水提物(SG)在一定濃度下對H2O2誘導(dǎo)的HUVECs損傷具有保護作用,活性最強的為CJ,濃度為50 μg.L~(-1)時,保護率為46.01%。與模型組比較,各提取物高、中、低劑量組細(xì)胞上清中分泌的GSH-Px、CAT和NO含量升高,ET~(-1)分泌降低(P0.05,0.01),且呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。2、選取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對象,建立高糖誘導(dǎo)的HUVECs氧化損傷模型,并以不同濃度的丹參莖葉及丹參水提物、醇提物、陽性藥氨基胍以及丹參中代表性丹酚酸、黃酮和丹參酮類化合物(迷迭香酸、丹酚酸B、蘆丁、異槲皮苷和隱丹參酮)進(jìn)行干預(yù),MTT法檢測各給藥組HUVECs存活率,相關(guān)試劑盒測定NO、ICAM~(-1)和TNF-α的含量變化。結(jié)果表明,與對照組相比,模型組HUVECs氧化應(yīng)激作用明顯增強,提取物中對HUVECs保護作用最強的為丹參莖葉醇提物(CJ),高劑量濃度為50μg·mL~(-1)時,保護率為67.23%。給藥后各指標(biāo)均向正常組回歸,揭示丹參莖葉及丹參提取物通過降低ICAM~(-1)和TNF-α水平,增加NO含量,從而改善高糖誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對HUVECs的損傷。
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【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285
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本文編號：1488951