本文關(guān)鍵詞：早期非小細(xì)胞肺癌中尋找與鑒定異常DNA甲基化的基因啟動(dòng)子及其和突變的關(guān)系研究　出處：《華東師范大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肺癌是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一。早檢測(cè)、早治療是戰(zhàn)勝肺癌的關(guān)鍵。DNA甲基化譜式異常是肺癌早期事件之一。這些大量的DNA甲基化修飾的改變可以作為一種潛在的生物標(biāo)志物運(yùn)用到肺癌臨床早期檢測(cè)中從而提高肺癌患者的生存率。另一方面,DNA甲基化的異常對(duì)肺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、耐藥性等方面有重要的影響。所以肺癌早期DNA甲基化異常的研究對(duì)肺癌形成的分子機(jī)制、尋找診斷指標(biāo)和預(yù)后判斷指標(biāo)有重要的臨床意義。隨著近幾年高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,我們有可能在全基因組水平精確檢測(cè)DNA甲基化的變化。本課題采用簡(jiǎn)化代表性重亞硫酸鹽測(cè)序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)方法探尋肺癌早期樣本中DNA甲基化的異常。首先,我們尋找到了 4775個(gè)差異甲基化CG二核苷酸位點(diǎn),根據(jù)聚類分析我們發(fā)現(xiàn)這些差異CG位點(diǎn)的甲基化水平能完全區(qū)分肺癌腫瘤樣本和癌旁樣本,這預(yù)示著DNA甲基化譜式改變是肺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵事件之一。在這些差異甲基化CG位點(diǎn)中,低甲基化位點(diǎn)(hypomethylated-CG)明顯多于高甲基化位點(diǎn)(hypermethylated-CG),這與腫瘤中整體DNA甲基化降低和局部甲基化升高的報(bào)道是吻合的。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)hypermethylated-CG中含CpG島的啟動(dòng)子(CpGi-promtoter)占 24%,而 hypomethylated-CG 中 CpGi-promoter 僅占 13.16%,表明高甲基化的CG位點(diǎn)集中在含CpG島的啟動(dòng)子區(qū)域。后續(xù)我們以差異甲基化片段(DMR)的分析方法對(duì)啟動(dòng)子區(qū)的甲基化異常進(jìn)行了研究。在6對(duì)肺癌樣本中同時(shí)出現(xiàn)高甲基化的啟動(dòng)子區(qū)DMR 一共9個(gè),包括了 PTTG1IP、DRICH1和AC139103.1等基因的啟動(dòng)子區(qū)。我們對(duì)PTTG1IP基因的啟動(dòng)子區(qū)甲基化進(jìn)行了深入研究,擴(kuò)大樣本研究驗(yàn)證了 PTTG1IP啟動(dòng)子在肺癌腫瘤組織和細(xì)胞系中高甲基化,而且PTTG1IP基因在腫瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá),啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平和表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。通過使用5-aza-CdR降低肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549的DNA甲基化水平,我們驗(yàn)證PTTG1IP啟動(dòng)子區(qū)甲基化下降與其表達(dá)量上升直接相關(guān)。進(jìn)而我們?cè)贏549細(xì)胞中過表達(dá)PTTG1IP,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制。綜合這些結(jié)果我們推測(cè)PTTG1IP在肺癌中通過啟動(dòng)子區(qū)高甲基化抑制表達(dá),減少了對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制,可能是早期肺癌中一個(gè)腫瘤抑制基因。另一方面,我們通過KEGG和GO分析發(fā)現(xiàn)甲基化變化劇烈異常區(qū)域主要集中在與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等有關(guān)的mTOR和MAPK信號(hào)通路中。說明在肺癌早期這些通路的部分基因已發(fā)生異常。因?yàn)槟[瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)異常調(diào)控同時(shí)存在,為了進(jìn)一步闡明突變與DNA甲基化修飾在肺癌中的作用關(guān)系,我們利用RRBS數(shù)據(jù)進(jìn)行了突變分析。本研究根據(jù)亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA測(cè)序數(shù)據(jù)中單核苷酸變異判斷標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)了應(yīng)用于RRBS數(shù)據(jù)的腫瘤特異性變異(Tumor specific variants,TSV)的生物信息篩選流程。我們篩選到高頻突變的基因共計(jì)364個(gè),主要富集在磷脂酰肌醇信號(hào)通路中。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)TP53等已知腫瘤相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)也存在突變。為了驗(yàn)證DNA高甲基化和突變之間的普遍關(guān)系,是否存在突變引起DNA甲基化改變導(dǎo)致基因沉默,我們利用篩選到的突變頻率在0.4-0.6的TSV分析突變和甲基化之間的關(guān)系。通過研究我們發(fā)現(xiàn)A-G和T-C這兩種TSV突變類型會(huì)造成reads整體甲基化變化幅度加大。其他類型的突變對(duì)reads整體甲基化沒有影響。此外,我們還發(fā)現(xiàn)TSV發(fā)生區(qū)域臨近CG位置甲基化要明顯低于鄰近區(qū)域,并且X-A(X為T、G、C)和X-T(X為A、G、C)六種突變后造成臨近突變位點(diǎn)CG甲基化下降,相對(duì)甲基化變化高達(dá)到7%。綜上所述,通過TSV和所在位點(diǎn)甲基化的研究揭示了在腫瘤中表觀遺傳和經(jīng)典遺傳學(xué)之間存在一定的相互影響。但是這種聯(lián)系在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中最終起到怎樣的作用還需要進(jìn)一步的研究。
[Abstract]:In this study , we found that the methylation level of DNA methylation in lung cancer was significantly higher than that of hypermethylation . In this study , we found that the methylation level of CpG islands in lung cancer was significantly higher than that of hypermethylation . In conclusion , the methylation of TSV and site methylation revealed that there was a certain interaction between apparent inheritance and classical genetics in the tumor . But this association also needed further research in the genesis and development of the tumor .

【學(xué)位授予單位】：華東師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1395285