本文關鍵詞：誘導多能干細胞（iPS）的功能與其向黑素細胞分化能力的差異性研究　出處：《江蘇大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:誘導多能干細胞(iPS細胞)向黑素細胞的分化過程需耗費大量經(jīng)費和極長時間,然而不同的i PS細胞功能差異很大,分化能力也各有差異,因此有必要對iPS細胞功能進行評估,從而選擇更好的iPS細胞進行后期的分化研究。旨在探討iPS細胞功能與其向黑素細胞分化能力的差異性。方法:(1)制備iPS細胞并選擇多個iPS細胞株,檢測并比較其AP染色強度、干細胞表面標志物、干性基因表達水平、體外擬胚體的形成以及畸胎瘤的結果;(2)在體外嘗試將這些iPS細胞株向黑素細胞誘導分化,并對誘導的黑素細胞進行初步鑒定;(3)根據(jù)檢測比較iPS細胞株的結果進行評估細胞的功能,并觀察后期能否誘導出黑素細胞,從而研究分析iPS細胞功能與其向黑素細胞分化能力的差異。結果:(1)在堿性磷酸酶染色上,iPSC-1、i PSC-2和iPSC-3被堿性磷酸酶染色均呈陽性表達,表明iPSC都處于未分化狀態(tài)。但其中iPSC-1堿性磷酸酶染色陽性強于iPSC-2和i PSC-3;(2)在干細胞表面標志物表達上,經(jīng)細胞免疫熒光染色后iPSC-1、iPSC-2和iPSC-3均能表達干細胞表面標志物OCT4和NANOG,說明iPSC都具有干性。但在iPSC-1中,核定位的OCT4和NANOG熒光團比iPSC-2和iPSC-3更密集,表明其克隆內細胞更緊湊;(3)在干性基因表達上,iPSC-1、i PSC-2和iPSC-3均能表達Oct4、Sox2、Nanog、Rex1、GDF3、DNMT3B干性基因,表明iPSC都具有干性,且iPSC-1干性基因表達水平高于iPSC-2和i PSC-3,說明iPSC-1干性更好;(4)在體外擬胚體形成上,與i PSC-2和iPSC-3相比,iPSC-1體外第一天形成擬胚體的形態(tài)更圓、邊界更清晰,第三天觀察其體積更大,說明iPSC-1來源的擬胚體生長速度更快、體外分化能力更好;(5)在畸胎瘤形成上,將iPSC注入免疫缺陷型小鼠體內兩個月后,iPSC-1可成功形成畸胎瘤,而iPSC-2和i PSC-3未能形成畸胎瘤,表明iPSC-1具有體內分化的多能性;(6)在體外定向分化為黑素細胞上,iPSC-1在第3周分化為黑素樣細胞,通過細胞學形態(tài)和細胞沉淀顏色觀察及黑素相關基因檢測,證實iPSC-1成功分化為黑素細胞,而iPSC-2和i PSC-3分化過程中未形成黑素細胞。結論:不同的iPS細胞在功能上存在差異,其中堿性磷酸酶活性更高、干細胞表面標志物及干性基因表達水平更高、體外擬胚體形態(tài)更好以及體內可成功形成畸胎瘤的iPS細胞其功能更好,在體外能成功誘導分化為黑素細胞,即iPS細胞功能越好,則其向黑素細胞分化的能力越強。iPS細胞功能的差異會導致其定向分化為黑素細胞存在差異。
[Abstract]:Objective: to induce the differentiation of pluripotent stem cells into melanocytes, it takes a lot of money and a long time to differentiate into melanocytes. However, the function of different iPS cells is very different, and the ability of differentiation is also different. Therefore, it is necessary to evaluate the function of iPS cells. The purpose of this study was to explore the difference between the function of iPS cells and their ability to differentiate into melanocytes. IPS cells were prepared and several iPS cell lines were selected. The AP staining intensity, stem cell surface markers, dry gene expression, embryoid formation in vitro and the results of teratoma were detected and compared. (2) the iPS cells were induced to differentiate into melanocytes in vitro, and the melanocytes were preliminarily identified. The function of iPS cell line was evaluated according to the results of detection and comparison, and the melanocyte induction was observed at the later stage. The difference between the function of iPS cells and their differentiation into melanocytes was analyzed. Results: the iPS cells were stained with alkaline phosphatase (ALP). I PSC-2 and iPSC-3 were positive by alkaline phosphatase staining. The results showed that all iPSC were undifferentiated, but iPSC-1 alkaline phosphatase staining was stronger than that of iPSC-2 and I PSC-3. (2) in the expression of stem cell surface markers, both iPSC-1 and iPSC-3 could express OCT4 and NANOG after cell immunofluorescence staining. The results showed that both iPSC were dry, but in iPSC-1, the nuclear localized OCT4 and NANOG fluorescent groups were denser than those of iPSC-2 and iPSC-3, which indicated that the cloned cells were more compact. (3) both PSC-2 and iPSC-3 could express Oct4S0x2 NanogRex1 (GDF3) on dry gene expression. The dry genes of DNMT3B indicated that all iPSC had dryness, and the expression level of iPSC-1 dryness gene was higher than that of iPSC-2 and I PSC-3, which indicated that iPSC-1 had better dryness. (4) compared with I PSC-2 and iPSC-3, the formation of in vitro embryoid body was more round, the boundary was clearer and the volume was larger on the third day than I PSC-2 and iPSC-3. The results showed that the embryoid derived from iPSC-1 grew faster and had better differentiation ability in vitro. (5) in the formation of teratoma, two months after injecting iPSC into immunodeficient mice, iPSC SC-1 could successfully form teratoma, but iPSC-2 and I PSC-3 could not form teratoma. The results showed that iPSC-1 had pluripotency of differentiation in vivo. In vitro, iPSC-1 differentiated into melanocyte-like cells at the 3rd week. The morphology of cells and the color of cell sedimentation were observed and the melanin-related genes were detected. It was confirmed that iPSC-1 differentiated into melanocytes successfully, but no melanocytes were formed in the differentiation between iPSC-2 and I PSC-3. Conclusion: different iPS cells have different functions. The activity of alkaline phosphatase is higher, the expression level of stem cell surface marker and dry gene is higher, the morphology of embryoid body in vitro is better and the function of iPS cells which can successfully form teratoma in vivo is better. The better the function of iPS cells is, the stronger the ability to differentiate into melanocytes. The difference in function of IPs cells will lead to the difference of their directional differentiation into melanocytes. 3. The differentiation of melanocytes into melanocytes can be induced successfully in vitro, that is, the better the function of iPS cells is, the stronger the ability to differentiate into melanocytes.
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R329.2

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