本文關(guān)鍵詞：葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)肝癌細(xì)胞IGF-1R信號(hào)通路活化的抑制作用研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:探討葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)通過抑制IGF-1R信號(hào)通路活化從而發(fā)揮抗肝癌作用的新機(jī)制,為其臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.IGF-1R表達(dá)抑制肝癌Huh7細(xì)胞株建立采用siRNA基因沉默技術(shù),依據(jù)siRNA靶序列設(shè)計(jì)原則,針對(duì)Huh7細(xì)胞IGF-1R序列,設(shè)計(jì)并合成三對(duì)核苷酸干擾序列,克隆入慢病毒pLVX-shRNA1載體,對(duì)shRNA表達(dá)的重組質(zhì)粒提取、酶切鑒定,證實(shí)其序列與設(shè)計(jì)序列完全一致。提取純化高質(zhì)量的重組質(zhì)粒,使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝,收集病毒液,濃縮,純化病毒液。用病毒感染Huh7細(xì)胞,經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。通過 Western blot 法檢測(cè) anti-IGF-1R Huh7 細(xì)胞(II 和 12)、Huh7-NC細(xì)胞和Huh7細(xì)胞中IGF-1R基因和蛋白表達(dá)的差異。2.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞增殖的影響采用MTT法檢測(cè)不同濃度葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用48h對(duì)Huh7細(xì)胞、anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞增殖的抑制作用效果,并計(jì)算出藥物半數(shù)抑制濃度;設(shè)置對(duì)照組、葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組4個(gè)復(fù)孔,檢測(cè)藥物作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞24h、48h的抑制作用效果。3.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞凋亡的影響設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高劑量組(3.Omg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個(gè)復(fù)孔。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h后,采用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。4.葉夏珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞基因表達(dá)的影響設(shè)置細(xì)胞對(duì)照組、葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)高劑量組(3.Omg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個(gè)復(fù)孔。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用于Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h后,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞及anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞中IGF-1R信號(hào)通路基因表達(dá)的影響。結(jié)果:1.與Huh7細(xì)胞組比較,Huh7-NC、I1、12細(xì)胞組中IGF-1R的表達(dá)明顯降低(P0.05),其中I1細(xì)胞組中IGF-1R的表達(dá)最低,故選取I1細(xì)胞作為穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,即anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞株構(gòu)建成功。2.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用于Huh7細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度為2.575mg/ml,作用于anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h的半數(shù)抑制濃度為1.686mg/ml。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用(P0.05),且隨劑量增加,抑制效果越明顯。葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用24h后,對(duì)anti-IGF-1RHuh7細(xì)胞的抑制作用比Huh7細(xì)胞更明顯(P0.05);葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用48h后,對(duì)anti-IGF-1RHuh7細(xì)胞的抑制作用比Huh7細(xì)胞更強(qiáng),差異具有顯著性意義(P0.05)。3.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用于Huh7細(xì)胞48h后,細(xì)胞早期凋亡率對(duì)比對(duì)照組顯著升高(P0.05),說明葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)對(duì)Huh7細(xì)胞有誘導(dǎo)其早期凋亡的作用。4.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)作用于Huh7細(xì)胞和anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞48h后,Huh7細(xì)胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF 和 ERK1 基因的 mRNA 表達(dá)顯著降低(P0.05);anti-IGF-1RHuh7 細(xì)胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF和ERK1等基因的表達(dá)顯著降低(P0.05)。與Huh7細(xì)胞相比,葉下珠復(fù)方Ⅱ治療后anti-IGF-1R Huh7細(xì)胞IGF-1R、PI3K及AKT3基因的mRNA表達(dá)水平明顯更低(P0.05)。結(jié)論:1.葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào)可以明顯抑制Huh7細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)Huh7細(xì)胞凋亡,作用機(jī)制與抑制IGF-1R信號(hào)通路活化有關(guān)。2.在siRNA技術(shù)抑制Huh7細(xì)胞IGF-1R表達(dá)情況下,使用葉下珠復(fù)方Ⅱ號(hào),可以起到抗癌協(xié)同作用。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

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9 程e，

本文編號(hào)：1324707