本文關鍵詞：葉下珠復方Ⅱ號對肝癌細胞IGF-1R信號通路活化的抑制作用研究　出處：《廣州中醫(yī)藥大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 葉下珠復方Ⅱ號 Huh-7 anti-IGF-1R Huh7 增殖抑制 凋亡 IGF-1R

【摘要】：目的:探討葉下珠復方Ⅱ號通過抑制IGF-1R信號通路活化從而發(fā)揮抗肝癌作用的新機制,為其臨床應用提供新的實驗依據(jù)。方法:1.IGF-1R表達抑制肝癌Huh7細胞株建立采用siRNA基因沉默技術,依據(jù)siRNA靶序列設計原則,針對Huh7細胞IGF-1R序列,設計并合成三對核苷酸干擾序列,克隆入慢病毒pLVX-shRNA1載體,對shRNA表達的重組質(zhì)粒提取、酶切鑒定,證實其序列與設計序列完全一致。提取純化高質(zhì)量的重組質(zhì)粒,使用高效重組載體和病毒包裝質(zhì)粒共轉染293T細胞,進行病毒包裝,收集病毒液,濃縮,純化病毒液。用病毒感染Huh7細胞,經(jīng)篩選后獲得穩(wěn)定感染的細胞株。通過 Western blot 法檢測 anti-IGF-1R Huh7 細胞(II 和 12)、Huh7-NC細胞和Huh7細胞中IGF-1R基因和蛋白表達的差異。2.葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞增殖的影響采用MTT法檢測不同濃度葉下珠復方Ⅱ號作用48h對Huh7細胞、anti-IGF-1R Huh7細胞增殖的抑制作用效果,并計算出藥物半數(shù)抑制濃度;設置對照組、葉下珠復方Ⅱ號高劑量組(3.0mg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組4個復孔,檢測藥物作用于Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞24h、48h的抑制作用效果。3.葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞凋亡的影響設置細胞對照組、葉下珠復方Ⅱ號高劑量組(3.Omg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個復孔。葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞48h后,采用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡率。4.葉夏珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞基因表達的影響設置細胞對照組、葉下珠復方Ⅱ號高劑量組(3.Omg/ml)、低劑量組(1.5mg/ml)、5-FU組(30μg/ml),每組3個復孔。葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞48h后,采用實時熒光定量PCR技術檢測葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞及anti-IGF-1R Huh7細胞中IGF-1R信號通路基因表達的影響。結果:1.與Huh7細胞組比較,Huh7-NC、I1、12細胞組中IGF-1R的表達明顯降低(P0.05),其中I1細胞組中IGF-1R的表達最低,故選取I1細胞作為穩(wěn)轉細胞株,即anti-IGF-1R Huh7細胞株構建成功。2.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞48h的半數(shù)抑制濃度為2.575mg/ml,作用于anti-IGF-1R Huh7細胞48h的半數(shù)抑制濃度為1.686mg/ml。葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞的增殖均有明顯的抑制作用(P0.05),且隨劑量增加,抑制效果越明顯。葉下珠復方Ⅱ號作用24h后,對anti-IGF-1RHuh7細胞的抑制作用比Huh7細胞更明顯(P0.05);葉下珠復方Ⅱ號作用48h后,對anti-IGF-1RHuh7細胞的抑制作用比Huh7細胞更強,差異具有顯著性意義(P0.05)。3.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞48h后,細胞早期凋亡率對比對照組顯著升高(P0.05),說明葉下珠復方Ⅱ號對Huh7細胞有誘導其早期凋亡的作用。4.葉下珠復方Ⅱ號作用于Huh7細胞和anti-IGF-1R Huh7細胞48h后,Huh7細胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF 和 ERK1 基因的 mRNA 表達顯著降低(P0.05);anti-IGF-1RHuh7 細胞中 IGF-1R 及 PI3K、AKT3、N-RAS、K-RAS、C-RAF和ERK1等基因的表達顯著降低(P0.05)。與Huh7細胞相比,葉下珠復方Ⅱ治療后anti-IGF-1R Huh7細胞IGF-1R、PI3K及AKT3基因的mRNA表達水平明顯更低(P0.05)。結論:1.葉下珠復方Ⅱ號可以明顯抑制Huh7細胞增殖和誘導Huh7細胞凋亡,作用機制與抑制IGF-1R信號通路活化有關。2.在siRNA技術抑制Huh7細胞IGF-1R表達情況下,使用葉下珠復方Ⅱ號,可以起到抗癌協(xié)同作用。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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