本文關(guān)鍵詞：酸敏感離子通道1a抑制劑的設(shè)計(jì)、合成以及活性篩選　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：酸敏感離子通道(Acid sensing ion channels,ASICs),屬于退化因子/上皮鈉通道(degenerin/epithelial sodium channel,DEG/ENa C)超家族中的一員,在酸性條件下能夠被H+活化,通道開(kāi)放。到目前為止,在哺乳動(dòng)物中至少有7個(gè)ASIC亞基(ASIC1a,ASIC1b,ASIC1b2,ASIC2a,ASIC2b,ASIC3,ASIC4)已被克隆及鑒定。局部組織酸化可以激活A(yù)SICs,進(jìn)而導(dǎo)致疾病的發(fā)生,ASICs很可能在組織酸化相關(guān)疾病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的研究表明,在ASIC亞基中,ASIC1a在伴隨著局部組織酸化的疾病如腫瘤、炎癥、癲癇及腦缺血等發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演者重要角色,阻斷ASIC1a具有一定程度的保護(hù)作用,而現(xiàn)在仍缺乏高效、選擇性強(qiáng)的小分子ASIC1a抑制劑。為此,本研究通過(guò)先合成可能具有抑制ASIC1a的化合物,再以大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞為研究對(duì)象,探討化合物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白表達(dá)及功能的影響。目的:合成ASIC1a抑制劑(6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives)以及體外觀察其對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)及功能的影響。方法:1.以6-溴-2-萘甲酸為起始原料,通過(guò)適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)轉(zhuǎn)化及Heck反應(yīng)來(lái)合成6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone derivatives,采用核磁共振氫譜(~1H NMR)和高分辨質(zhì)譜(HR-MS)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證。2.使用II型膠原酶消化分離提取大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞,將細(xì)胞分為正常組、溶劑DMSO組、化合物五個(gè)濃度組及陽(yáng)性藥阿米洛利(Amiloride)組,觀察化合物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率的影響;軟骨細(xì)胞被分為五組分別在pH 7.4、pH 7.0、pH6.5、pH 6.0、pH 5.5的培養(yǎng)基中孵育以及于胞外酸化(pH 6.0)刺激0min、30min、1h、3h、6h、12h,觀察兩者條件下對(duì)軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白表達(dá)的影響,選取最適條件用于觀察化合物對(duì)軟骨細(xì)胞中ASIC1a表達(dá)的影響;使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察胞外酸化(pH 6.0)刺激下化合物對(duì)軟骨細(xì)胞中[Ca~(2+)]i水平的影響。結(jié)果:1.本實(shí)驗(yàn)合成了8個(gè)新型化合物,分別為:5a:6-Styryl-naphthalene-2-amidrazone;5b:6-[2-(4-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5c:6-[2-(4-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5d:6-[2-(2-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5e:6-[2-(4-Methoxy-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5f:6-[2-(3-Fluoro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5g:6-[2-(3-Chloro-phenyl)-vinyl]-naphthalene-2-amidrazone;5h:6-(2-p-Tolyl-vinyl)-naphthalene-2-amidrazone,~1H NMR和HR-MS表明其結(jié)構(gòu)正確。2.MTT結(jié)果表明,除化合物5h外,與正常組相比,其余化合物對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞生存率無(wú)顯著性差異;Western Blot結(jié)果表明,1)與正常組相比,pH 6.0與pH 5.5能顯著升高軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá),二者之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,2)pH 6.0刺激3h之前ASIC1a蛋白表達(dá)逐漸升高,3h之后逐漸降低,由此,選取pH 6.0刺激3h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件,3)與pH 6.0+DMSO組相比,除化合物5b外,其余化合物均能顯著降低軟骨細(xì)胞中ASIC1a蛋白的表達(dá);激光共聚焦結(jié)果表明,化合物5a(25mM)、5c(50mM)、5d(25mM)、5e(50mM)、5g(25mM)、5h(50mM)均能降低胞外酸化(pH 6.0)刺激下軟骨細(xì)胞中[Ca~(2+)]i水平,其抑制程度分別為33.37%、20.83%、52.07%、81.40%、59.51%、63.23%,大部分活性可能均優(yōu)于Amiloride(100mM,抑制程度:23.49%),其中以化合物5e或5g的效果最好。結(jié)論:8個(gè)新型化合物被合成,大部分能夠影響ASIC1a蛋白表達(dá)及功能,具有潛在的ASIC1a阻斷作用,其中,以化合物5e或5g的效果最好(抑制程度分別為:81.40%(5e,50mM)及59.51%(5g,25mM))。結(jié)合ASIC1a在組織酸化性疾病包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎病理過(guò)程中的重要作用,研究結(jié)果可能為靶向組織酸化性疾病的藥物設(shè)計(jì)提供一個(gè)新的選擇。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R914;R96

【參考文獻(xiàn)】

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1 周仁鵬;陳飛虎;;酸敏感離子通道在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中作用的研究進(jìn)展[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2015年03期

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本文編號(hào)：1323737