本文關(guān)鍵詞：INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的調(diào)控及其在宮頸癌中的表達(dá)　出處：《山東大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2012年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示,全球每年新發(fā)宮頸癌病例大約53萬,其中約80%的病例在發(fā)展中國家。因此在發(fā)展中國家宮頸癌已成為女性中僅次于乳腺癌的第二殺手。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染和兩種病毒癌蛋白E6/E7的持續(xù)表達(dá)是誘導(dǎo)宮頸癌發(fā)生的主要因素。然而,在HPV感染人群中只有少數(shù)發(fā)展為宮頸癌,說明HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要但不充分條件。高危型HPV感染促進(jìn)了細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化的發(fā)展,病毒感染后細(xì)胞基因的不穩(wěn)定性導(dǎo)致的突變積累以及細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)的變化是正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤細(xì)胞的關(guān)鍵步驟。磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是PI3K/AKT通路中的一種磷酸酶,其主要底物是磷脂酰肌醇3,4-二磷酸鹽[PI(3,4)P2],INPP4B催化水解[PI(3,4)P2]的4位磷酸基團(tuán)生成磷脂酰肌醇3-磷酸鹽[PI(3)P],降低[PI(3,4)P2]的水平。還有文獻(xiàn)報道INPP4B可以直接水解[PI(3,4,5)P3]中的4位磷酸基團(tuán),減少[PI(3,4,5)P3]。通過這些反應(yīng)INPP4B可抑制AKT的活性。已有研究表明,作為PI3K/AKT途徑中的負(fù)調(diào)因子,INPP4B參與調(diào)控細(xì)胞增殖,細(xì)胞遷移,DNA損傷反應(yīng)等過程。近幾年臨床與生物學(xué)研究佐證了 INPP4B在腫瘤中的復(fù)雜作用。在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等腫瘤的雜合性缺失譜分析中發(fā)現(xiàn)INPP4B的雜合性缺失與患者存活率下降密切相關(guān)。在前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中,INPP4B可通過抑制AKT活性阻礙腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲以及小鼠移植瘤的生長。然而,也有研究表明INPP4B在結(jié)腸癌、急性白血病(acute myeloid leukemia,AML)以及黑色素瘤中發(fā)揮了致癌活性,INPP4B通過激活SGK3(serum-and glucocorticoid-regulated kinase 3,SGK3)途徑促進(jìn)細(xì)胞的生長增殖。所以,INPP4B的作用具有腫瘤甚至細(xì)胞特異性。迄今為止,INPP4B在宮頸癌中的表達(dá)及其對宮頸癌細(xì)胞的作用尚未見報道,本研究通過體內(nèi)外實驗探索了 INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖、周期和凋亡的影響及其分子機(jī)制,并進(jìn)一步觀察分析了INPP4B在臨床宮頸癌標(biāo)本中的表達(dá)狀況。1.INPP4B抑制宮頸癌細(xì)胞的生長增殖目的:研究INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的影響。方法:將INPP4B表達(dá)質(zhì)粒LHCX-INPP4B轉(zhuǎn)染INPP4B表達(dá)缺失的HeLa細(xì)胞,SiHa細(xì)胞以及C33a細(xì)胞,通過CCK-8實驗,BrdU實驗以及克隆形成實驗檢測上述宮頸癌細(xì)胞的生長增殖。同時利用細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測INPP4B對細(xì)胞凋亡的影響。在INPP4B高表達(dá)的CaSki細(xì)胞中采用INPP4B特異性siRNA干擾其表達(dá),用克隆形成及BrdU實驗檢測細(xì)胞的增殖活性。結(jié)果:CCK-8和克隆形成實驗顯示,過表達(dá)INPP4B使宮頸癌細(xì)胞活性和克隆形成能力明顯下降,BrdU實驗表明,轉(zhuǎn)染INPP4B后宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入S期的細(xì)胞比例減少。特異性siRNA干擾實驗結(jié)果表明,敲低INPP4B表達(dá)促進(jìn)了 CaSki細(xì)胞的生長增殖。但過表達(dá)INPP4B對上述宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡無明顯影響。結(jié)論:INPP4B可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程,但對宮頸癌細(xì)胞凋亡沒有明顯促進(jìn)作用。2.INPP4B表達(dá)對宮頸癌細(xì)胞中AKT活性的影響目的:觀察宮頸癌細(xì)胞中INPP4B表達(dá)對AKT活性的影響。方法:在HeLa,SiHa和C33a細(xì)胞中過表達(dá)INPP4B,在CaSki細(xì)胞中敲低INPP4B表達(dá),48h后收集細(xì)胞蛋白行western blot檢測。結(jié)果:與對照細(xì)胞相比,過表達(dá)INPP4B導(dǎo)致HeLa和C33a細(xì)胞中pAKT表達(dá)含量降低,但敲低INPP4B表達(dá)對CaSki細(xì)胞中pAKT水平?jīng)]有明顯影響。結(jié)論:INPP4B抑制宮頸癌細(xì)胞增殖的作用可能部分依賴于其對AKT活性的負(fù)調(diào)控。3.HPV E6/E7蛋白對宮頸癌細(xì)胞INPP4B表達(dá)的影響目的:探討HPVE6/E7轉(zhuǎn)化蛋白對INPP4B表達(dá)的影響。方法:選擇高表達(dá)INPP4B并有HPV16 E6,E7表達(dá)背景的CaSki細(xì)胞,采用特異性siRNA單獨(dú)敲低E6表達(dá)或同時敲低E6和E7表達(dá),western blot檢測有關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果:敲低E6、以及E6/E7表達(dá)后,CaSki細(xì)胞中p53蛋白水平增加,pAKT表達(dá)水平明顯降低,INPP4B表達(dá)輕度降低。結(jié)論:HPVE6/E7癌蛋白可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞中pAKT活性增高,并有可能通過PI3K/AKT途徑的反饋調(diào)節(jié)影響INPP4B的表達(dá)。4.INPP4B抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞移植瘤的生長目的:通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的抑制作用。方法:利用本室構(gòu)建的INPP4B穩(wěn)轉(zhuǎn)宮頸癌細(xì)胞株GV367-INPP4BHeLa,注射小鼠皮下建立裸鼠成瘤實驗?zāi)Ｐ�。成瘤后進(jìn)行動物活體成像拍照以及裸鼠移植瘤重量,大小等指標(biāo)的分析,觀察INPP4B過表達(dá)對宮頸癌移植瘤生長的影響。結(jié)果:與對照GV367-HeLa細(xì)胞相比,穩(wěn)定表達(dá)INPP4B蛋白的GV367-INPP4B HeLa細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長速度明顯緩慢,最終形成腫瘤的大小和重量也明顯低于對照組。結(jié)論:過表達(dá)INPP4B可在體內(nèi)抑制裸鼠宮頸癌異體移植瘤的生長。5.臨床宮頸組織中INPP4B蛋白的表達(dá)目的:研究正常宮頸以及宮頸鱗癌組織中INPP4B的表達(dá)情況。方法:收取臨床正常宮頸以及宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織,real time-PCR以及免疫組化方法檢測INPP4B的表達(dá)。結(jié)果:免疫組化表明,66例宮頸鱗癌組織中,INPP4B陽性率為39.4%,INPP4B缺失率接近60%。在43例正常宮頸鱗狀上皮中,INPP4B陽性率為32.5%。統(tǒng)計學(xué)分析表明,正常宮頸與宮頸癌組織中INPP4B的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異,real time PCR與免疫組化的結(jié)果一致。上述結(jié)果與Oncomine數(shù)據(jù)庫中的已有數(shù)據(jù)相符。結(jié)論:INPP4B表達(dá)在正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織中沒有明顯差異。我們分析正常宮頸組織中INPP4B的表達(dá)率較低的原因,可能與正常宮頸細(xì)胞中缺少改變細(xì)胞生長的刺激因素,使INPP4B表達(dá)未被充分誘導(dǎo)有關(guān)。綜上所述,本研究利用體內(nèi)外實驗探究了 INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的影響,并初步觀察了 INPP4B在臨床宮頸標(biāo)本中的表達(dá)特點。研究發(fā)現(xiàn):1)過表達(dá)INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖有抑制作用。2)INPP4B過表達(dá)可抑制裸鼠體內(nèi)宮頸癌細(xì)胞移植瘤的生長。3)INPP4B對宮頸癌細(xì)胞生長增殖的抑制作用部分依賴于其對于AKT活性的負(fù)調(diào)控。4)HPVE6/E7癌蛋白可增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞中pAKT活性,從而影響INPP4B的表達(dá)。本研究為宮頸癌變的分子機(jī)制研究提供了新的理論及實驗依據(jù),INPP4B有望成為宮頸癌治療的潛在新靶點,值得進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Zhai Lu;Hua Chen;Xiao-Mei Zheng;Man-Ling Chen;;Expression and clinical significance of high risk human papillomavirus and invasive gene in cervical carcinoma[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年02期

2 Joycelyn JX Lee;Kiley Loh;Yoon-Sim Yap;;PI3K/Akt/mTOR inhibitors in breast cancer[J];Cancer Biology & Medicine;2015年04期

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本文編號：1319074