本文關鍵詞：INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的調控及其在宮頸癌中的表達　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 宮頸癌 INPP4B 細胞增殖

【摘要】：宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。據2012年統(tǒng)計數據顯示,全球每年新發(fā)宮頸癌病例大約53萬,其中約80%的病例在發(fā)展中國家。因此在發(fā)展中國家宮頸癌已成為女性中僅次于乳腺癌的第二殺手。高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染和兩種病毒癌蛋白E6/E7的持續(xù)表達是誘導宮頸癌發(fā)生的主要因素。然而,在HPV感染人群中只有少數發(fā)展為宮頸癌,說明HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要但不充分條件。高危型HPV感染促進了細胞向惡性轉化的發(fā)展,病毒感染后細胞基因的不穩(wěn)定性導致的突變積累以及細胞內蛋白表達的變化是正常細胞轉化為腫瘤細胞的關鍵步驟。磷脂酰肌醇4-磷酸酶Ⅱ型(INPP4B)是PI3K/AKT通路中的一種磷酸酶,其主要底物是磷脂酰肌醇3,4-二磷酸鹽[PI(3,4)P2],INPP4B催化水解[PI(3,4)P2]的4位磷酸基團生成磷脂酰肌醇3-磷酸鹽[PI(3)P],降低[PI(3,4)P2]的水平。還有文獻報道INPP4B可以直接水解[PI(3,4,5)P3]中的4位磷酸基團,減少[PI(3,4,5)P3]。通過這些反應INPP4B可抑制AKT的活性。已有研究表明,作為PI3K/AKT途徑中的負調因子,INPP4B參與調控細胞增殖,細胞遷移,DNA損傷反應等過程。近幾年臨床與生物學研究佐證了 INPP4B在腫瘤中的復雜作用。在乳腺癌、卵巢癌和黑色素瘤等腫瘤的雜合性缺失譜分析中發(fā)現INPP4B的雜合性缺失與患者存活率下降密切相關。在前列腺癌、乳腺癌和黑色素瘤中,INPP4B可通過抑制AKT活性阻礙腫瘤細胞的增殖、侵襲以及小鼠移植瘤的生長。然而,也有研究表明INPP4B在結腸癌、急性白血病(acute myeloid leukemia,AML)以及黑色素瘤中發(fā)揮了致癌活性,INPP4B通過激活SGK3(serum-and glucocorticoid-regulated kinase 3,SGK3)途徑促進細胞的生長增殖。所以,INPP4B的作用具有腫瘤甚至細胞特異性。迄今為止,INPP4B在宮頸癌中的表達及其對宮頸癌細胞的作用尚未見報道,本研究通過體內外實驗探索了 INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖、周期和凋亡的影響及其分子機制,并進一步觀察分析了INPP4B在臨床宮頸癌標本中的表達狀況。1.INPP4B抑制宮頸癌細胞的生長增殖目的:研究INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的影響。方法:將INPP4B表達質粒LHCX-INPP4B轉染INPP4B表達缺失的HeLa細胞,SiHa細胞以及C33a細胞,通過CCK-8實驗,BrdU實驗以及克隆形成實驗檢測上述宮頸癌細胞的生長增殖。同時利用細胞凋亡檢測試劑盒檢測INPP4B對細胞凋亡的影響。在INPP4B高表達的CaSki細胞中采用INPP4B特異性siRNA干擾其表達,用克隆形成及BrdU實驗檢測細胞的增殖活性。結果:CCK-8和克隆形成實驗顯示,過表達INPP4B使宮頸癌細胞活性和克隆形成能力明顯下降,BrdU實驗表明,轉染INPP4B后宮頸癌細胞進入S期的細胞比例減少。特異性siRNA干擾實驗結果表明,敲低INPP4B表達促進了 CaSki細胞的生長增殖。但過表達INPP4B對上述宮頸癌細胞的細胞凋亡無明顯影響。結論:INPP4B可抑制宮頸癌細胞的生長增殖和細胞周期進程,但對宮頸癌細胞凋亡沒有明顯促進作用。2.INPP4B表達對宮頸癌細胞中AKT活性的影響目的:觀察宮頸癌細胞中INPP4B表達對AKT活性的影響。方法:在HeLa,SiHa和C33a細胞中過表達INPP4B,在CaSki細胞中敲低INPP4B表達,48h后收集細胞蛋白行western blot檢測。結果:與對照細胞相比,過表達INPP4B導致HeLa和C33a細胞中pAKT表達含量降低,但敲低INPP4B表達對CaSki細胞中pAKT水平沒有明顯影響。結論:INPP4B抑制宮頸癌細胞增殖的作用可能部分依賴于其對AKT活性的負調控。3.HPV E6/E7蛋白對宮頸癌細胞INPP4B表達的影響目的:探討HPVE6/E7轉化蛋白對INPP4B表達的影響。方法:選擇高表達INPP4B并有HPV16 E6,E7表達背景的CaSki細胞,采用特異性siRNA單獨敲低E6表達或同時敲低E6和E7表達,western blot檢測有關蛋白的表達。結果:敲低E6、以及E6/E7表達后,CaSki細胞中p53蛋白水平增加,pAKT表達水平明顯降低,INPP4B表達輕度降低。結論:HPVE6/E7癌蛋白可促進宮頸癌細胞中pAKT活性增高,并有可能通過PI3K/AKT途徑的反饋調節(jié)影響INPP4B的表達。4.INPP4B抑制裸鼠體內宮頸癌細胞移植瘤的生長目的:通過體內實驗進一步驗證INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的抑制作用。方法:利用本室構建的INPP4B穩(wěn)轉宮頸癌細胞株GV367-INPP4BHeLa,注射小鼠皮下建立裸鼠成瘤實驗模型。成瘤后進行動物活體成像拍照以及裸鼠移植瘤重量,大小等指標的分析,觀察INPP4B過表達對宮頸癌移植瘤生長的影響。結果:與對照GV367-HeLa細胞相比,穩(wěn)定表達INPP4B蛋白的GV367-INPP4B HeLa細胞在裸鼠體內的生長速度明顯緩慢,最終形成腫瘤的大小和重量也明顯低于對照組。結論:過表達INPP4B可在體內抑制裸鼠宮頸癌異體移植瘤的生長。5.臨床宮頸組織中INPP4B蛋白的表達目的:研究正常宮頸以及宮頸鱗癌組織中INPP4B的表達情況。方法:收取臨床正常宮頸以及宮頸鱗狀細胞癌組織,real time-PCR以及免疫組化方法檢測INPP4B的表達。結果:免疫組化表明,66例宮頸鱗癌組織中,INPP4B陽性率為39.4%,INPP4B缺失率接近60%。在43例正常宮頸鱗狀上皮中,INPP4B陽性率為32.5%。統(tǒng)計學分析表明,正常宮頸與宮頸癌組織中INPP4B的表達水平沒有顯著差異,real time PCR與免疫組化的結果一致。上述結果與Oncomine數據庫中的已有數據相符。結論:INPP4B表達在正常宮頸組織與宮頸鱗癌組織中沒有明顯差異。我們分析正常宮頸組織中INPP4B的表達率較低的原因,可能與正常宮頸細胞中缺少改變細胞生長的刺激因素,使INPP4B表達未被充分誘導有關。綜上所述,本研究利用體內外實驗探究了 INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的影響,并初步觀察了 INPP4B在臨床宮頸標本中的表達特點。研究發(fā)現:1)過表達INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖有抑制作用。2)INPP4B過表達可抑制裸鼠體內宮頸癌細胞移植瘤的生長。3)INPP4B對宮頸癌細胞生長增殖的抑制作用部分依賴于其對于AKT活性的負調控。4)HPVE6/E7癌蛋白可增強宮頸癌細胞中pAKT活性,從而影響INPP4B的表達。本研究為宮頸癌變的分子機制研究提供了新的理論及實驗依據,INPP4B有望成為宮頸癌治療的潛在新靶點,值得進一步深入研究。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R737.33

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 Zhai Lu;Hua Chen;Xiao-Mei Zheng;Man-Ling Chen;;Expression and clinical significance of high risk human papillomavirus and invasive gene in cervical carcinoma[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年02期

2 Joycelyn JX Lee;Kiley Loh;Yoon-Sim Yap;;PI3K/Akt/mTOR inhibitors in breast cancer[J];Cancer Biology & Medicine;2015年04期

，

本文編號：1319074