本文關(guān)鍵詞：雙重?zé)晒舛縋CR方法鑒別阪崎克羅諾桿菌和丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：克羅諾桿菌屬(Cronobacter spp.)細菌是一類極其重要的革蘭氏陰性食源性致病菌,該屬的細菌可以感染人體引起非常嚴重的疾病,尤其是在剛出生不久的嬰兒中最易發(fā)病,其治愈率低且致死性強。最新的分類的研究發(fā)現(xiàn),克羅諾桿菌屬細菌包含7個不同的種,分別是阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)、丙二酸鹽陽性克羅諾桿菌(Cronobacter malonaticus)、蘇黎世克羅諾桿菌(Cronobacter turicensis)、穆汀斯克羅諾桿菌(Cronobacter muytjensii)、康帝蒙提克羅諾桿菌(Cronobacter condimenti)、尤尼沃斯克羅諾桿菌(Cronobacter universalis)和都柏林克羅諾桿菌(Cronobacter dublinensis)。MLST數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/cronobacter)顯示,在所有已知的分離到的克羅諾桿菌屬菌株中,C.sakazakii和C.malonaticus是數(shù)量最多、分布最廣的兩個種,其中C.sakazakii占分離總數(shù)的65.5%,C.malonaticus占分離總數(shù)的11.99%,因此關(guān)于這兩個種的特征以及鑒別方法的研究具有重要意義。在本研究中,我們建立了一套雙重?zé)晒舛縋CR鑒定體系,將C.sakazakii和C.malonaticus從克羅諾桿菌屬菌株中鑒別出來,相比傳統(tǒng)的分種方法,本方法用時更少,靈敏度更高。首先,我們利用前人針對克羅諾桿菌屬菌株的dnaG基因設(shè)計的MMS探針和引物體系,對本研究中用到的112株菌株進行熒光定量PCR實驗,鑒定這些菌株是否為克羅諾桿菌屬菌株。在確定所用菌株都為克羅諾桿菌屬菌株之后,再用我們建立的雙重?zé)晒舛縋CR體系將C.sakazakii和C.malonaticus這兩個種鑒別出來,也就是說雙重?zé)晒舛縋CR分種方法是在確定菌株為克羅諾桿菌屬菌株的基礎(chǔ)上進行的。具體而言,根據(jù)C.sakazakii和C.malonaticus的fusA基因和16s rRNA基因的特異性序列分別設(shè)計了CSM-CTD和CS-CMA兩套探針及引物,建立和優(yōu)化反應(yīng)體系,對112株克羅諾桿菌屬不同種的菌株(包含56株Cronobacter sakazakii,32株Cronobacter malonaticus,16株Cronobacter dublinensis,6株Cronobacter turicensis和2株Cronobacter muytjensii)進行鑒別,評價體系的可靠性,結(jié)果顯示,我們建立的雙重?zé)晒舛縋CR體系可以準(zhǔn)確的將56株Cronobacter sakazakii和32株Cronobacter malonaticus鑒別出來,結(jié)果與用fusA基因分種鑒定結(jié)果一致。其次,分別利用Cronobacter sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544和Cronobacter malonaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 18702的純菌核酸和人工污染奶粉模擬樣本的核酸進行梯度熒光定量PCR實驗檢測體系靈敏度。結(jié)果顯示,CSM-CTD探針和CS-CMA探針對Cronobacter sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544純菌核酸的檢測下限均為102 CFU/ml,CSM-CTD探針對Cronobacter malonaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 18702純菌核酸的檢測下限也為102 CFU/ml;CSM-CTD探針和CS-CMA探針對Cronobacter sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544人工污染奶粉模擬樣本核酸的檢測下限為103 CFU/g,CSM-CTD探針對Cronobacter malonaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM18702人工污染奶粉模擬樣本核酸的檢測下限也為103 CFU/g。最后,為了對檢測結(jié)果進行絕對定量,我們分別將Cronobacter sakazakii和Cronobacter malonaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株的CSM-CTD和CS-CMA這兩個片段擴增出來,通過將載體質(zhì)粒導(dǎo)入到感受態(tài)細胞,構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并測定其標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出,反應(yīng)的Ct值與起始模板量的對數(shù)值之間有著良好的線性關(guān)系。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線,我們測定CSM-CTD探針對Cronobacter sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544純菌核酸檢測的最小拷貝數(shù)為131 copies/ul,CSM-CTD探針對Cronobacter malonaticus標(biāo)準(zhǔn)菌株DSM 18702純菌核酸檢測的最小拷貝數(shù)為136 copies/ul,CS-CMA探針對Cronobacter sakazakii標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 29544純菌核酸檢測的最小拷貝數(shù)為16 copies/ul。綜上,本研究建立的雙重?zé)晒舛縋CR分種方法可作為克羅諾桿菌屬菌株快速、準(zhǔn)確、靈敏的分種方法,尤其是可以快速的檢測出嬰幼兒配方奶粉中是否含有易導(dǎo)致嬰幼兒致病的Cronobacter sakazakii,因此,具有較大的應(yīng)用價值。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R440

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