本文關鍵詞：葒草素對于氧化應激狀態(tài)下人支氣管上皮細胞的作用及機制研究

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【摘要】：背景和目的:氧化應激是指機體在各種不利因素刺激下導致體內(nèi)活性氧的蓄積,氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài),也是宿主對抗外界病原菌的先天性免疫反應重要的防御系統(tǒng)。但過度的氧化應激可能導致系統(tǒng)性的炎癥反應和組織損傷[1-4]。相關研究表明,氧化應激與肺部疾病(如COPD、哮喘等)有明確的關系[1、7、17、18]:(1)氧化劑可使中性粒細胞的變形能力減弱,促使其在微循環(huán)中聚集、活化,活化的中性粒細胞釋放ROS,導致組織損傷;(2)氧化應激可以通過激活胞內(nèi)信號通路(如:核因子-KB等)調(diào)節(jié)炎癥介質的釋放,活化中性粒細胞,進一步放大炎癥損傷作用[5];(3)通過激活Rho蛋白,氧化應激可以引起巨噬細胞的重構,損傷巨噬細胞的功能,從而導致巨噬細胞不能正常清除病原體、異物及凋亡細胞等[6-7];(4)氧化應激可以導致組蛋白去乙�；�2活性降低,促使慢阻肺患者對糖皮質激素敏感性下降[8-9];(5)ROS產(chǎn)生增加可以誘導中性粒細胞釋放蛋白酶,破壞肺組織彈性纖維,促使蛋白酶與抗蛋白酶失衡,導致肺氣腫的發(fā)生。葒草素是傳統(tǒng)中藥竹葉的有效成分,屬于黃酮類化合物[10]。葒草素作用廣泛,具有顯著的抗氧化,抗凋亡,鎮(zhèn)痛,抗脂質形成和抗炎[11-16]等作用。其主要成分已投入臨床使用的有葒葉通心軟膠囊和葒草復方凍干粉制劑。氧化應激狀態(tài)下葒草素對人支氣管上皮細胞的研究尚不多見,本研究通過體外細胞學實驗,應用過氧化氫刺激人支氣管上皮細胞,給予不同濃度的葒草素干預,檢測其對細胞存活率、凋亡率、形態(tài)學及相關蛋白表達情況,探討氧化損傷時葒草素對人支氣管上皮細胞的作用及機制。實驗方法:1.人支氣管上皮細胞(16HBE細胞)的培養(yǎng):RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清,37℃、5%CO_2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2-3天傳代一次;2.過氧化氫對16HBE細胞存活率的影響:用不同濃度(20、100、200uM)的H_2O_2攻擊16HBE細胞2h,MTT檢測細胞的存活率;3.不同濃度的葒草素(Orientin)干預后細胞存活率的變化:實驗分為以下五組,空白對照組(細胞加培養(yǎng)基)、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin 5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2(200uM)+Orientin(5uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(10uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(40uM),干預的總時間均為 2h,MTT檢測細胞存活率;4.熒光顯微鏡觀察凋亡細胞形態(tài)變化:Hoechst33342對16HBE細胞凋亡染色觀察細胞形態(tài);5.Annexin-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率;6.Western Blot方法檢測各組細胞Cleaved-caspase3/procaspase3凋亡蛋白的表達情況;7.酶標儀檢測細胞內(nèi)SOD(U/mg)的活力;8.Orientin干預后對P-AKT/AKT通路的影響:提取細胞蛋白,Western Blot方法檢測各組細胞P-AKT/AKT蛋白的表達水平。技術路線圖:結果:1.16HBE細胞在不同濃度H_2O_2刺激下細胞的存活率:予以不同濃度(20、100、200uM)H_2O_2刺激16HBE細胞2h,以MTT法檢測細胞存活率。與Con組(97.88±1.87%)相比,H_2O_2隨著濃度的增加細胞存活率逐漸降低,20uM H_2O_2刺激16HBE細胞存活率為95.75±3.90%,無明顯的統(tǒng)計學差異;100uM的H_2O_2濃度刺激時,細胞的存活率為75.86±1.01%,H_2O_2濃度達到200uM時,存活率降至57.76±2.10%,差別具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);因此,選擇200uM H_2O_2作用16HBE細胞2h為誘導氧化應激的最佳濃度;2.Orientin可以增加氧化應激下16HBE細胞的存活率:實驗分為以下幾組:空白對照組、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2+Orientin(5uM)、H_2O_2+Orientin(10uM)、H_2O_2+Orientin(40uM),MTT法檢測細胞存活率。DMSO40uM及Orientin(5uM、10uM、40uM)組和空白對照組相比均無統(tǒng)計學差異(圖2)。H_2O_2組的細胞存活率與空白對照組相比,明顯降低,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin5uM時與H_2O_2組相比,細胞存活率有所增加,但差別無統(tǒng)計學意義;H_2O_2+OrientinK)uM時細胞存活率明顯增加,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);H_2O_2+Orientin40uM時和H_2O_2相比較細胞存活率增加,差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)(圖3、表2);3.Hoechst33342染色觀察凋亡細胞形態(tài)學:熒光顯微鏡下觀察空白對照組16HBE細胞活力良好,染料能少許進入正常細胞,細胞核顏色為低藍色,核染色均勻;H_2O_2組凋亡細胞較多,膜通透性增加,核呈亮藍色,有些核破裂、皺縮、染色不均勻;Orientin 10uM+H_2O_2組凋亡細胞減少,細胞核低藍色多,亮藍色少,細胞核大部分染色較均勻;Orientin 40uM+H_2O_2組凋亡細胞較H_2O_2組有所減少,亮藍色,低藍色多(圖4);4.Annexin-FITC/PI流式檢測細胞凋亡率:實驗分為以下幾組Con、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM、H_2O_2+Ori40uM。與Con組凋亡率(0.21±0.05%)相比,H_2O_2組凋亡率為(66.74±7.53%),早凋加晚凋的細胞數(shù)明顯增多,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。H_2O_2+ORI10uM組凋亡率(49.02±6.20%)與H_2O_2組相比,早凋加晚凋的細胞數(shù)量明顯減少,差別具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。H_2O_2+Ori40uM組凋亡率(51.21±6.98%)與H_2O_2組相比,早凋加晚凋的細胞數(shù)量減少,但差別無明顯的統(tǒng)計學差異(P0.05);5.Orientin可以拮抗氧化應激狀態(tài)下Caspase3凋亡蛋白的表達:Western blot結果顯示(圖6),和空白對照組相比,氧化應激組的16HBE細胞Cleaved-caspase3表達水平增加,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);與H_2O_2組相比,H_2O_2+Orientin1OuM干預后,Cleaved-caspase3凋亡蛋白表達水平降低,總的Caspase3水平無明顯變化,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin40uM組較H_2O_2組凋亡蛋白的表達有所降低,具有統(tǒng)計學差異(P0.05);6.酶標儀檢測細胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD活力:橫坐標為實驗分組:CON、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM,H_2O_2+Ori40uM,縱坐標反應SOD(U/mg)的活力。由圖7、表5可見和CON組(68.76±2.99U/mg)相比,H_2O_2組(34.71±2.55U/mg)SOD的活力明顯下降,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Orientin(10uM)+H_2O_2組SOD的活力(45.09±2.19U/mg)較H_2O_2組有所增加,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05);Orientin(40uM)+H_2O_2組SOD的活力(41.05±0.75 U/mg)較H_2O_2組有所增加,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)(圖7,表5);7.P-AKT信號通路參與了Orientin對氧化應激狀態(tài)下支氣管上皮細胞的保護作用:Western blot法檢測16HBE細胞的的P-AKT/AKT蛋白表達。如圖圖、表6所示:和CON組相比,H_2O_2組P-AKT/AKT的蛋白表達水平明顯降低,H_2O_2+Orientin(10uM)組與氧化應激組相比,P-AKT/AKT蛋白的表達水平明顯增加,差別具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin(40uM)組較H_2O_2組P-AKT/AKT表達有所增加,但差別無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1、過氧化氫刺激可導致體外培養(yǎng)16HBE細胞存活率降低;2、一定濃度的葒草素使得氧化應激狀態(tài)下16HBE細胞的凋亡率降低,凋亡相關蛋白下降,說明葒草素對氧化損傷的保護作用是通過抑制凋亡而產(chǎn)生;3、葒草素抑制凋亡是通過增加T-SOD的活力來對16HBE細胞起保護作用;4、葒草素抗氧化的作用可能與P-AKT/AKT信號通路有關;5、葒草素在濃度5uM和10uM時抗氧化能力增強,當濃度達到40uM時,其抗氧化作用減弱。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285

【參考文獻】

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中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

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本文編號：1301198