本文關(guān)鍵詞：葒草素對(duì)于氧化應(yīng)激狀態(tài)下人支氣管上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景和目的:氧化應(yīng)激是指機(jī)體在各種不利因素刺激下導(dǎo)致體內(nèi)活性氧的蓄積,氧化與抗氧化失衡的一種狀態(tài),也是宿主對(duì)抗外界病原菌的先天性免疫反應(yīng)重要的防御系統(tǒng)。但過度的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致系統(tǒng)性的炎癥反應(yīng)和組織損傷[1-4]。相關(guān)研究表明,氧化應(yīng)激與肺部疾病(如COPD、哮喘等)有明確的關(guān)系[1、7、17、18]:(1)氧化劑可使中性粒細(xì)胞的變形能力減弱,促使其在微循環(huán)中聚集、活化,活化的中性粒細(xì)胞釋放ROS,導(dǎo)致組織損傷;(2)氧化應(yīng)激可以通過激活胞內(nèi)信號(hào)通路(如:核因子-KB等)調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放,活化中性粒細(xì)胞,進(jìn)一步放大炎癥損傷作用[5];(3)通過激活Rho蛋白,氧化應(yīng)激可以引起巨噬細(xì)胞的重構(gòu),損傷巨噬細(xì)胞的功能,從而導(dǎo)致巨噬細(xì)胞不能正常清除病原體、異物及凋亡細(xì)胞等[6-7];(4)氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致組蛋白去乙酰化酶2活性降低,促使慢阻肺患者對(duì)糖皮質(zhì)激素敏感性下降[8-9];(5)ROS產(chǎn)生增加可以誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞釋放蛋白酶,破壞肺組織彈性纖維,促使蛋白酶與抗蛋白酶失衡,導(dǎo)致肺氣腫的發(fā)生。葒草素是傳統(tǒng)中藥竹葉的有效成分,屬于黃酮類化合物[10]。葒草素作用廣泛,具有顯著的抗氧化,抗凋亡,鎮(zhèn)痛,抗脂質(zhì)形成和抗炎[11-16]等作用。其主要成分已投入臨床使用的有葒葉通心軟膠囊和葒草復(fù)方凍干粉制劑。氧化應(yīng)激狀態(tài)下葒草素對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的研究尚不多見,本研究通過體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn),應(yīng)用過氧化氫刺激人支氣管上皮細(xì)胞,給予不同濃度的葒草素干預(yù),檢測其對(duì)細(xì)胞存活率、凋亡率、形態(tài)學(xué)及相關(guān)蛋白表達(dá)情況,探討氧化損傷時(shí)葒草素對(duì)人支氣管上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制。實(shí)驗(yàn)方法:1.人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE細(xì)胞)的培養(yǎng):RPMI-1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清,37℃、5%CO_2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2-3天傳代一次;2.過氧化氫對(duì)16HBE細(xì)胞存活率的影響:用不同濃度(20、100、200uM)的H_2O_2攻擊16HBE細(xì)胞2h,MTT檢測細(xì)胞的存活率;3.不同濃度的葒草素(Orientin)干預(yù)后細(xì)胞存活率的變化:實(shí)驗(yàn)分為以下五組,空白對(duì)照組(細(xì)胞加培養(yǎng)基)、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin 5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2(200uM)+Orientin(5uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(10uM)、H_2O_2(200uM)+Orientin(40uM),干預(yù)的總時(shí)間均為 2h,MTT檢測細(xì)胞存活率;4.熒光顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)變化:Hoechst33342對(duì)16HBE細(xì)胞凋亡染色觀察細(xì)胞形態(tài);5.Annexin-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;6.Western Blot方法檢測各組細(xì)胞Cleaved-caspase3/procaspase3凋亡蛋白的表達(dá)情況;7.酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)SOD(U/mg)的活力;8.Orientin干預(yù)后對(duì)P-AKT/AKT通路的影響:提取細(xì)胞蛋白,Western Blot方法檢測各組細(xì)胞P-AKT/AKT蛋白的表達(dá)水平。技術(shù)路線圖:結(jié)果:1.16HBE細(xì)胞在不同濃度H_2O_2刺激下細(xì)胞的存活率:予以不同濃度(20、100、200uM)H_2O_2刺激16HBE細(xì)胞2h,以MTT法檢測細(xì)胞存活率。與Con組(97.88±1.87%)相比,H_2O_2隨著濃度的增加細(xì)胞存活率逐漸降低,20uM H_2O_2刺激16HBE細(xì)胞存活率為95.75±3.90%,無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;100uM的H_2O_2濃度刺激時(shí),細(xì)胞的存活率為75.86±1.01%,H_2O_2濃度達(dá)到200uM時(shí),存活率降至57.76±2.10%,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);因此,選擇200uM H_2O_2作用16HBE細(xì)胞2h為誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的最佳濃度;2.Orientin可以增加氧化應(yīng)激下16HBE細(xì)胞的存活率:實(shí)驗(yàn)分為以下幾組:空白對(duì)照組、H_2O_2(200uM)、DMSO40uM、Orientin5uM、Orientin 10uM、Orientin 40uM、H_2O_2+Orientin(5uM)、H_2O_2+Orientin(10uM)、H_2O_2+Orientin(40uM),MTT法檢測細(xì)胞存活率。DMSO40uM及Orientin(5uM、10uM、40uM)組和空白對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2)。H_2O_2組的細(xì)胞存活率與空白對(duì)照組相比,明顯降低,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin5uM時(shí)與H_2O_2組相比,細(xì)胞存活率有所增加,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;H_2O_2+OrientinK)uM時(shí)細(xì)胞存活率明顯增加,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);H_2O_2+Orientin40uM時(shí)和H_2O_2相比較細(xì)胞存活率增加,差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖3、表2);3.Hoechst33342染色觀察凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué):熒光顯微鏡下觀察空白對(duì)照組16HBE細(xì)胞活力良好,染料能少許進(jìn)入正常細(xì)胞,細(xì)胞核顏色為低藍(lán)色,核染色均勻;H_2O_2組凋亡細(xì)胞較多,膜通透性增加,核呈亮藍(lán)色,有些核破裂、皺縮、染色不均勻;Orientin 10uM+H_2O_2組凋亡細(xì)胞減少,細(xì)胞核低藍(lán)色多,亮藍(lán)色少,細(xì)胞核大部分染色較均勻;Orientin 40uM+H_2O_2組凋亡細(xì)胞較H_2O_2組有所減少,亮藍(lán)色,低藍(lán)色多(圖4);4.Annexin-FITC/PI流式檢測細(xì)胞凋亡率:實(shí)驗(yàn)分為以下幾組Con、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM、H_2O_2+Ori40uM。與Con組凋亡率(0.21±0.05%)相比,H_2O_2組凋亡率為(66.74±7.53%),早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)明顯增多,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。H_2O_2+ORI10uM組凋亡率(49.02±6.20%)與H_2O_2組相比,早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)量明顯減少,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。H_2O_2+Ori40uM組凋亡率(51.21±6.98%)與H_2O_2組相比,早凋加晚凋的細(xì)胞數(shù)量減少,但差別無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);5.Orientin可以拮抗氧化應(yīng)激狀態(tài)下Caspase3凋亡蛋白的表達(dá):Western blot結(jié)果顯示(圖6),和空白對(duì)照組相比,氧化應(yīng)激組的16HBE細(xì)胞Cleaved-caspase3表達(dá)水平增加,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與H_2O_2組相比,H_2O_2+Orientin1OuM干預(yù)后,Cleaved-caspase3凋亡蛋白表達(dá)水平降低,總的Caspase3水平無明顯變化,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin40uM組較H_2O_2組凋亡蛋白的表達(dá)有所降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);6.酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶SOD活力:橫坐標(biāo)為實(shí)驗(yàn)分組:CON、H_2O_2、H_2O_2+Ori10uM,H_2O_2+Ori40uM,縱坐標(biāo)反應(yīng)SOD(U/mg)的活力。由圖7、表5可見和CON組(68.76±2.99U/mg)相比,H_2O_2組(34.71±2.55U/mg)SOD的活力明顯下降,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Orientin(10uM)+H_2O_2組SOD的活力(45.09±2.19U/mg)較H_2O_2組有所增加,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Orientin(40uM)+H_2O_2組SOD的活力(41.05±0.75 U/mg)較H_2O_2組有所增加,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)(圖7,表5);7.P-AKT信號(hào)通路參與了Orientin對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下支氣管上皮細(xì)胞的保護(hù)作用:Western blot法檢測16HBE細(xì)胞的的P-AKT/AKT蛋白表達(dá)。如圖圖、表6所示:和CON組相比,H_2O_2組P-AKT/AKT的蛋白表達(dá)水平明顯降低,H_2O_2+Orientin(10uM)組與氧化應(yīng)激組相比,P-AKT/AKT蛋白的表達(dá)水平明顯增加,差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。H_2O_2+Orientin(40uM)組較H_2O_2組P-AKT/AKT表達(dá)有所增加,但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1、過氧化氫刺激可導(dǎo)致體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞存活率降低;2、一定濃度的葒草素使得氧化應(yīng)激狀態(tài)下16HBE細(xì)胞的凋亡率降低,凋亡相關(guān)蛋白下降,說明葒草素對(duì)氧化損傷的保護(hù)作用是通過抑制凋亡而產(chǎn)生;3、葒草素抑制凋亡是通過增加T-SOD的活力來對(duì)16HBE細(xì)胞起保護(hù)作用;4、葒草素抗氧化的作用可能與P-AKT/AKT信號(hào)通路有關(guān);5、葒草素在濃度5uM和10uM時(shí)抗氧化能力增強(qiáng),當(dāng)濃度達(dá)到40uM時(shí),其抗氧化作用減弱。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 王如峰;賡迪;吳秀穩(wěn);安燕南;;金蓮花中四種主要成分的抗炎活性研究[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2012年09期

2 黃勇;何峰;張治蓉;鄭林;蘭燕宇;王永林;;HPLC-MS-MS同時(shí)檢測大鼠血漿中葒草素、牡荊素和槲皮苷[J];中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2012年01期

3 黃勇;鄭林;王愛民;蘭燕宇;李勇軍;何迅;王永林;;葒草不同藥用部位抗心肌缺血作用及化學(xué)成分比較研究[J];時(shí)珍國醫(yī)國藥;2010年10期

4 秦嶺;胡成平;;支氣管上皮細(xì)胞在呼吸道免疫紊亂中的作用[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2010年04期

5 文秀芳;周向東;;氣道上皮杯狀細(xì)胞化生和分泌調(diào)控[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2008年01期

6 付曉春;李少鵬;汪小根;嚴(yán)振;;葒草苷的抗血栓作用研究[J];中國藥房;2006年17期

7 劉和亮,趙金垣;氧化應(yīng)激和肺損傷[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2002年05期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 王慧曄;葒草苷抗MIRI作用中的自噬機(jī)制研究[D];中央民族大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：1301198