本文關(guān)鍵詞：肺癌胸水中游離核酸及沉淀細胞的基因突變檢測

  更多相關(guān)文章： 肺癌 惡性胸腔積液 游離核酸多重 PCR 二代測序技術(shù)

【摘要】：實驗?zāi)康?體細胞突變是癌癥的重要特征之一。癌癥患者的基因突變檢測越來越多地用于診斷、預(yù)后及治療。由于腫瘤具有侵襲性,一些腫瘤不能通過手術(shù)的方式來獲得標本;而且腫瘤具有異質(zhì)性,單一局部的組織活檢獲取的腫瘤基因突變不能全面反映腫瘤的真實狀況。近年來,越來越多的報道發(fā)現(xiàn)癌癥患者體液中含有循環(huán)腫瘤細胞及腫瘤游離DNA(cell free DNA),體液中腫瘤游離DNA能夠更加全面地反映全身腫瘤的變異情況。相比組織活檢,檢測體液中cf DNA突變能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)地動態(tài)檢測腫瘤的進展。因此,以癌癥患者體液為材料的“液態(tài)活檢”成為腫瘤基因突變檢測領(lǐng)域的熱點,并逐步應(yīng)用于臨床無創(chuàng)檢測中。胸腔積液是重要的體液,是肺癌的重要特征,尤其是晚期的肺癌,成為肺癌基因突變研究的重要材料。目前,對于惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細胞的腫瘤相關(guān)基因的檢測主要集中于一個基因的某幾個位點上。還沒有一個高效并全面覆蓋多個基因的建庫測序方法來檢測惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細胞的腫瘤相關(guān)基因突變。本課題目的在于建立并優(yōu)化覆蓋50個癌癥相關(guān)熱點基因的外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系和相應(yīng)的擴增子文庫,借助高通量測序技術(shù)來檢測惡性胸腔積液中目標基因突變。我們對12例肺癌患者的惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細胞的靶基因突變情況進行了深入研究,為肺癌的臨床診療提供理論基礎(chǔ)。實驗方法:(1)通過在線引物設(shè)計工具:Design Studio設(shè)計覆蓋50個癌癥熱點基因外顯子區(qū)域的多重PCR引物;(2)驗證并優(yōu)化靶基因區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系;(3)提取肺癌患者胸水及其沉淀細胞中的游離核酸和基因組DNA并進行定量;(4)多重PCR擴增靶向基因的全部外顯子區(qū)域;(5)擴增子的末端修復(fù);(6)擴增子文庫的構(gòu)建;(7)文庫的質(zhì)控及Hi Seq Xten平臺測序;(8)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及深度挖掘。實驗結(jié)果:(1)建立并優(yōu)化了覆蓋50個癌癥熱點基因外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系。(2)建立了一種新的擴增子文庫構(gòu)建方法。(3)對肺癌患者胸水中的游離核酸以及沉淀細胞的50個癌癥熱點基因外顯子區(qū)域的測序數(shù)據(jù)進行了深度挖掘,實現(xiàn)了對目標基因高靈敏、高通量、無創(chuàng)檢測。實驗結(jié)論:(1)成功建立覆蓋50個癌癥相關(guān)熱點基因外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系,這套引物具有覆蓋率高,每個PCR反應(yīng)體系中的引物之間互相干擾性低等優(yōu)點。(2)建立一種新的用于癌癥檢測的循環(huán)腫瘤DNA靶向基因高通量檢測的文庫構(gòu)建方法和數(shù)據(jù)分析方法,極大地降低了建庫成本,加快了分析速度。(3)實現(xiàn)了以肺癌患者胸水為生物樣本、低濃度游離核酸為模板的高通量、高靈敏、無創(chuàng)基因檢測。本實驗方法將為腫瘤患者提供腫瘤基因突變的圖譜,為癌癥個體化醫(yī)療提供較為有利的技術(shù)支持,非常適用于臨床癌癥患者基因突變的篩查。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 魏冰;馬杰;馬智勇;王慧娟;楊科;;肺腺癌患者惡性胸腔積液中EGFR突變狀況分析[J];臨床與實驗病理學(xué)雜志;2012年03期

2 陳萬青;張思維;鄒小農(nóng);;中國肺癌發(fā)病死亡的估計和流行趨勢研究[J];中國肺癌雜志;2010年05期

3 宋小燕;徐兵;李潔;;改良國產(chǎn)試劑盒提取血漿DNA的方法[J];廣東醫(yī)學(xué);2008年06期

4 韓寶惠;;惡性胸腔積液的處理[J];中國實用內(nèi)科雜志;2008年02期

5 嚴子禾;潘世揚;陳丹;魏源華;高麗;謝而付;黃s顂，

本文編號：1297426