本文關(guān)鍵詞：肺癌胸水中游離核酸及沉淀細(xì)胞的基因突變檢測

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【摘要】：實(shí)驗(yàn)?zāi)康?體細(xì)胞突變是癌癥的重要特征之一。癌癥患者的基因突變檢測越來越多地用于診斷、預(yù)后及治療。由于腫瘤具有侵襲性,一些腫瘤不能通過手術(shù)的方式來獲得標(biāo)本;而且腫瘤具有異質(zhì)性,單一局部的組織活檢獲取的腫瘤基因突變不能全面反映腫瘤的真實(shí)狀況。近年來,越來越多的報(bào)道發(fā)現(xiàn)癌癥患者體液中含有循環(huán)腫瘤細(xì)胞及腫瘤游離DNA(cell free DNA),體液中腫瘤游離DNA能夠更加全面地反映全身腫瘤的變異情況。相比組織活檢,檢測體液中cf DNA突變能夠?qū)崿F(xiàn)無創(chuàng)地動(dòng)態(tài)檢測腫瘤的進(jìn)展。因此,以癌癥患者體液為材料的“液態(tài)活檢”成為腫瘤基因突變檢測領(lǐng)域的熱點(diǎn),并逐步應(yīng)用于臨床無創(chuàng)檢測中。胸腔積液是重要的體液,是肺癌的重要特征,尤其是晚期的肺癌,成為肺癌基因突變研究的重要材料。目前,對于惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細(xì)胞的腫瘤相關(guān)基因的檢測主要集中于一個(gè)基因的某幾個(gè)位點(diǎn)上。還沒有一個(gè)高效并全面覆蓋多個(gè)基因的建庫測序方法來檢測惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細(xì)胞的腫瘤相關(guān)基因突變。本課題目的在于建立并優(yōu)化覆蓋50個(gè)癌癥相關(guān)熱點(diǎn)基因的外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系和相應(yīng)的擴(kuò)增子文庫,借助高通量測序技術(shù)來檢測惡性胸腔積液中目標(biāo)基因突變。我們對12例肺癌患者的惡性胸腔積液中的cf DNA及其沉淀細(xì)胞的靶基因突變情況進(jìn)行了深入研究,為肺癌的臨床診療提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法:(1)通過在線引物設(shè)計(jì)工具:Design Studio設(shè)計(jì)覆蓋50個(gè)癌癥熱點(diǎn)基因外顯子區(qū)域的多重PCR引物;(2)驗(yàn)證并優(yōu)化靶基因區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系;(3)提取肺癌患者胸水及其沉淀細(xì)胞中的游離核酸和基因組DNA并進(jìn)行定量;(4)多重PCR擴(kuò)增靶向基因的全部外顯子區(qū)域;(5)擴(kuò)增子的末端修復(fù);(6)擴(kuò)增子文庫的構(gòu)建;(7)文庫的質(zhì)控及Hi Seq Xten平臺(tái)測序;(8)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析及深度挖掘。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)建立并優(yōu)化了覆蓋50個(gè)癌癥熱點(diǎn)基因外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系。(2)建立了一種新的擴(kuò)增子文庫構(gòu)建方法。(3)對肺癌患者胸水中的游離核酸以及沉淀細(xì)胞的50個(gè)癌癥熱點(diǎn)基因外顯子區(qū)域的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行了深度挖掘,實(shí)現(xiàn)了對目標(biāo)基因高靈敏、高通量、無創(chuàng)檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)成功建立覆蓋50個(gè)癌癥相關(guān)熱點(diǎn)基因外顯子區(qū)域的多重PCR反應(yīng)體系,這套引物具有覆蓋率高,每個(gè)PCR反應(yīng)體系中的引物之間互相干擾性低等優(yōu)點(diǎn)。(2)建立一種新的用于癌癥檢測的循環(huán)腫瘤DNA靶向基因高通量檢測的文庫構(gòu)建方法和數(shù)據(jù)分析方法,極大地降低了建庫成本,加快了分析速度。(3)實(shí)現(xiàn)了以肺癌患者胸水為生物樣本、低濃度游離核酸為模板的高通量、高靈敏、無創(chuàng)基因檢測。本實(shí)驗(yàn)方法將為腫瘤患者提供腫瘤基因突變的圖譜,為癌癥個(gè)體化醫(yī)療提供較為有利的技術(shù)支持,非常適用于臨床癌癥患者基因突變的篩查。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1297426