本文關(guān)鍵詞：n-3不飽和脂肪酸通過激活Nrf2-ARE信號通路對6-OHDA及α-synuclein帕金森病模型小鼠的保護(hù)作用

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【摘要】：[研究背景]帕金森病(Parkinson's Disease.PD)是世界第二大進(jìn)行性神經(jīng)退行性疾病,是發(fā)病最多的運動障礙疾病。PD的主要病理特征為黑質(zhì)致密部部位多巴胺能神經(jīng)元退行性變性和死亡以及包含錯誤折替α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)的路易氏體的形成。目前PD的發(fā)病機制仍不清楚,研究表明有多種損傷機制參與其中,氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、突觸核蛋白穩(wěn)態(tài)、線粒體功能障礙等都參與了 PD發(fā)病過程中多巴胺能神經(jīng)元的損傷。Nrf2-ARE信號通路是細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷最重要的內(nèi)源性通路之一。其在PD中所發(fā)揮的作用逐漸成為近年來的研究熱點之一。Nrf2(Nuclear transcription factor NF-E2-related factor 2)轉(zhuǎn)錄升高時可誘導(dǎo)抗氧化反應(yīng)元件(Antioxidant responsive element,ARE)相關(guān)蛋白轉(zhuǎn)錄,從而對抗細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生的損傷,起到保護(hù)作用。正常生理狀態(tài)下,Nrf2存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)受到氧化應(yīng)激時,Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核與特定的DNA位點ARE結(jié)合,啟動相關(guān)保護(hù)蛋白如血紅素加氧酶(Heme oxygenase,HO-1)以及谷胱甘肽(glutathione.GSH)相關(guān)調(diào)節(jié)酶的轉(zhuǎn)錄,以此產(chǎn)生對抗活性氧產(chǎn)生的氧化損傷。眾多研究表明,氧化應(yīng)激在PD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。因此,對抗活性氧產(chǎn)生的損傷是PD的一個重要的治療方向。Nrf2-ARE信號通路作為機體最重要的抗氧化通路,在對抗氧化應(yīng)激損傷方面具有重大潛力。激活該通路可為PD的治療提供新策略。尋找一種副作用少的高效Nrf2誘導(dǎo)劑可為PD病人提供更高的生活質(zhì)量。n-3 不飽和脂肪酸(n-3 polyunsaturated fatty acids,n-3 PUFAs)是人體一種重要的脂肪酸,參與了大腦的發(fā)育以及視網(wǎng)膜的組成,n-3 PUFAs主要包括DHA(Docosahexaenoicacid)和 EPA(EicosapentaenoicAcid)等,其中 DHA 是腦內(nèi)不飽和脂肪酸的主要組成部分,同時DHA也是神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞膜的主要成分。研究表明,n-3 PUFAs的攝入可降低PD的發(fā)病風(fēng)險。我們研究n-3 PUFAs是否是通過激活 Nrf2-ARE 信號通路對 6-hydroxydopamine(6-OHDA)及 α-syn 過表達(dá) PD 模型發(fā)揮保護(hù)作用。[研究目的]研究n-3 PUFAs是否通過激活Nrf2-ARE信號通路對6-OHDA及α-syn過表達(dá)PD小鼠模型產(chǎn)生抗氧化應(yīng)激和抗炎保護(hù)作用及作用機制。[研究方法]體外實驗:1.給予不同濃度的DHA預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h,MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況,觀察不同濃度的DHA是否會影響細(xì)胞自身的活性。2.分別給予SH-SY5Y和BV2細(xì)胞不同濃度的DHA預(yù)處理8 h或24 h,用western blot方法檢測Nrf2及下游蛋白HO-1的表達(dá)情況,觀察DHA是否可誘導(dǎo)Nrf2的蛋白表達(dá)。并在不同時間點用80 μM的DHA預(yù)處理細(xì)胞,觀察Nrf2及下游蛋白HO-1的表達(dá)是否隨時間的變化而變化。3.采用6-OHDA損傷SH-SY5Y細(xì)胞建立PD氧化應(yīng)激損傷細(xì)胞模型,給予SH-SY5Y細(xì)胞不同濃度的DHA預(yù)處理8 h,加入100μM的6-OHDA損傷24 h,MTT法檢測細(xì)胞存活率,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的凋亡情況和細(xì)胞內(nèi)ROS的變化,采用TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡情況,評價DHA對細(xì)胞的保護(hù)作用。4.給予BV2細(xì)胞不同濃度的DHA預(yù)處理8 h,加入LPS損傷24 h,用real time RT-PCR方法檢測細(xì)胞內(nèi)炎癥相關(guān)因子mRNA水平,觀察DHA是否可以減輕LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。5.采用Nrf2小干擾RNA干擾SH-SY5Y細(xì)胞Nrf2的表達(dá),給予SH-SY5Y細(xì)胞不同濃度的DHA預(yù)處理8 h,用western blot檢測Nrf2蛋白表達(dá)情況,驗證Nrf2 siRNA的干擾效率。并給予SH-SY5Y細(xì)胞不同濃度的DHA刺激8 h,加入6-OHDA損傷24 h,使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的凋亡情況。評價DHA對SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用是否仍然存在,以探索DHA是否是通過激活Nrf2實現(xiàn)其保護(hù)作用。體內(nèi)實驗:1.采用單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD氧化應(yīng)激損傷動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥35天。注射6-OHDA 1天后,無痛處死小鼠,取小鼠紋狀體,用western blot檢測Nrf2蛋白表達(dá)情況,觀察n-3 PUFAs是否可誘導(dǎo)Nrf2蛋白表達(dá)。2.采用單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD氧化應(yīng)激損傷動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥35天。注射6-OHDA 21天后麻醉無痛處死小鼠,心臟灌流,取全腦進(jìn)行冰凍切片,對黑質(zhì)和紋狀體部位進(jìn)行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)免疫組化染色,觀察多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)纖維損傷情況。。3.采用單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD氧化應(yīng)激損傷動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥35天。注射6-OHDA 7天及14天后,麻醉無痛處死小鼠,心臟灌流,取全腦進(jìn)行冰凍切片,對黑質(zhì)紋狀體部位進(jìn)行GFAP及IBA1熒光染色,觀察小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活情況。4.采用單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD氧化應(yīng)激損傷動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥35天。注射6-OHDA 21天后麻醉無痛處死小鼠,取紋狀體部位,用HPLC-MS法檢測紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine,DA)及其代謝產(chǎn)物二羥苯乙酸(dihydroxyphnylacetic acid,DOPAC)及高香草酸(homovanillicacid,HVA)含量。5.采用單側(cè)紋狀體立體定位注射6-OHDA建立PD氧化應(yīng)激損傷動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥35天。分別于注射6-OHDA 7天、14天及21天后,對小鼠皮下注射阿撲嗎啡誘導(dǎo)小鼠轉(zhuǎn)圈,統(tǒng)計30 min內(nèi)小鼠逆時針旋轉(zhuǎn)圈數(shù),評價模型小鼠的行為學(xué)改變。6.采用單側(cè)黑質(zhì)立體定位注射AAV-α-syn構(gòu)建α-syn過表達(dá)PD動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥14天。造模后繼續(xù)灌胃給藥21天。造模10周后麻醉無痛處死小鼠,取出全腦,進(jìn)行冰凍切片,對黑質(zhì)部位的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行TH熒光染色,觀察多巴胺能神經(jīng)元狀態(tài)。7.采用單側(cè)黑質(zhì)立體定位注射AAV-α-syn構(gòu)建α-syn過表達(dá)PD動物模型。C57BL/6小鼠分為正常對照組、6-OHDA模型組、6-OHDA+ n-3 PUFAs 2 g/kg組及6-OHDA+ n-3 PUFAs 4 g/kg組,造模前提前灌胃給藥14天。造模后繼續(xù)灌胃給藥21天。分別于造模后14天、21天對小鼠進(jìn)行曠場試驗,觀察其行為學(xué)變化。[實驗結(jié)果]1.DHA在0-200 μ范圍內(nèi)不影響SH-SY5Y細(xì)胞活性。2.DHA可誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Nrf2及HO-1的表達(dá),并且有一定的劑量依賴性。8 h的預(yù)處理可以使Nrf2的表達(dá)達(dá)到最高水平。3.DHA可以減少6-OHDA所致的SH-SY5Y細(xì)胞死亡,減輕細(xì)胞的凋亡和降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平;并且DHA可減輕LPS所致BV2細(xì)胞炎癥反應(yīng)。4.Nrf2 siRNA處理后,DHA的保護(hù)作用消失。5.n-3 PUFAs可在C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)Nrf2表達(dá)。并可顯著改善6-OHDA PD小鼠黑質(zhì)紋狀體通路多巴胺能神經(jīng)元的損傷,減輕6-OHDA所致神經(jīng)炎癥,改善小鼠的運動缺陷。6.n-3 PUFAs可顯著改善α-syn PD小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的減少,減輕小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng),對小鼠的行為學(xué)也有一定改善。[結(jié)論]n-3 PUFAs可對6-OHDA及α-syn PD小鼠發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,此作用可能通過激活Nrf2-ARE通路實現(xiàn)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R742.5;R-332

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