本文關(guān)鍵詞：賴氨酸氧化酶和血管內(nèi)皮生長因子在缺氧微環(huán)境中促進(jìn)乳腺癌發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究

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【摘要】：研究背景:乳腺癌在全球范圍內(nèi)為女性最常見的惡性腫瘤,死亡率較高。在腫瘤的演進(jìn)過程中,腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的最主要原因。缺氧微環(huán)境廣泛存在于實(shí)體腫瘤中,在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用,研究表明,25%-40%的侵襲性乳腺癌都發(fā)生在組織相對缺氧的區(qū)域。在缺氧微環(huán)境中,缺氧誘導(dǎo)因子1(Hypoxia-inducible factor HIF-1)被激活,從而調(diào)控其下游因子的表達(dá),包括賴氨酸氧化酶(lysyl oxidase LOX)和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial cell groeth factor VEGF),引起一系列的缺氧適應(yīng)性反應(yīng)。研究已經(jīng)證實(shí)腫瘤組織內(nèi)缺氧是影響腫瘤患者生存率的獨(dú)立因素(獨(dú)立于臨床分期、病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等)。缺氧部位的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲性表型,增加了乳腺癌的轉(zhuǎn)移風(fēng)險和對放、化療的耐受,并且誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸。大多數(shù)惡性腫瘤在演進(jìn)過程中均伴有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)過程的發(fā)生,EMT是上皮細(xì)胞經(jīng)過特定程序獲得細(xì)胞間質(zhì)表型特征的生物學(xué)過程。也是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的重要生物學(xué)過程,從而使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力,不僅如此,EMT在缺氧微環(huán)境中也發(fā)揮了重要的作用。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移及多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用,其主要特征包括細(xì)胞粘附分子(如E-鈣黏蛋白)表達(dá)減少、角蛋白細(xì)胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白(vimentin)為主的細(xì)胞骨架及形態(tài)上具有間質(zhì)細(xì)胞的特征,波形蛋白、纖維連接蛋白、N-鈣黏蛋白表達(dá)增多,多種蛋白酶表達(dá)升高,如基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)。在EMT過程中,上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性,失去與基底膜連接等的上皮表型,獲得了較高的遷移和侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)能力等的間質(zhì)表型。EMT是一個由多種途徑共同調(diào)控的過程,參與EMT過程的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括TGF-β/Smad途徑、Wnt/β-catenin途徑、受體酪氨酸激酶Ras-MAPK途徑、Src激酶、Rho家族激酶、PI3K/AKT途徑等。缺氧可影響EMT的相關(guān)基因表達(dá),進(jìn)一步誘導(dǎo)干細(xì)胞表型。EMT過程中,細(xì)胞和細(xì)胞之間的連接成分減少,細(xì)胞骨架重塑獲得紡錘樣的細(xì)胞形態(tài),動態(tài)的肌動蛋白微絲網(wǎng)絡(luò)移動性增加,為腫瘤轉(zhuǎn)移提供可能。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過程中,上皮細(xì)胞離開原發(fā)腫瘤部位,黏附并侵襲基質(zhì)部位,進(jìn)入血液循環(huán)并且擴(kuò)散到達(dá)遠(yuǎn)處的組織器官,在遠(yuǎn)處的組織內(nèi)增殖形成繼發(fā)腫瘤。EMT被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的這個復(fù)雜過程中的第一步。轉(zhuǎn)移是腫瘤致死的主要原因之一,因為腫瘤一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移,病灶將擴(kuò)散至全身,越來越多的研究顯示,缺氧微環(huán)境可以促使腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。50%-60%的實(shí)體腫瘤中存在低氧和(或)缺氧區(qū)域,低氧環(huán)境可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)重新編程,并最終導(dǎo)致細(xì)胞侵襲行為的發(fā)生。HIF-1通過上調(diào)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子或抑制因子,激活EMT相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,調(diào)控EMT相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子,同時也調(diào)控其他的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。比如,HIF-1通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控E-cadherin,SNAIL、ZEB1、TWIST、TCF3(transcription factor 3)幾種因子誘導(dǎo)EMT過程。本研究以人乳腺癌為研究對象,探討缺氧微環(huán)境與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化之間的相互作用,從而為藥物研發(fā)和臨床治療提供理論依據(jù)。方法:實(shí)驗分為兩組:空白對照組(0μmol/L),Co Cl2濃度梯度處理組(50μmol/L,100μmol/L,200μmol/L,400μmol/L)。(1)劃痕實(shí)驗檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力的變化:各處理組的細(xì)胞無血清培養(yǎng)48h,分別于0h,24h以及48h時取樣拍照,測量細(xì)胞遷移距離。采用Transwell實(shí)驗檢測各組細(xì)胞侵襲能力的變化:各處理組細(xì)胞分別培養(yǎng)24h以及48h后取樣拍照,并計數(shù)其穿膜細(xì)胞數(shù)量。(2)Western blot技術(shù)檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)蛋白水平的變化。檢測指標(biāo)包括:缺氧誘導(dǎo)因子HIF,金屬基質(zhì)蛋白9—MMP-9,上皮標(biāo)記物—E-cadherin,間質(zhì)標(biāo)記物—Vimentin,PI3K-AKT通路關(guān)鍵分子—PI3K,AKT。(3)ELISA技術(shù)檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞分泌物中分泌型蛋白的表達(dá)。檢測指標(biāo)包括:血管內(nèi)皮生長因子—VEGF,賴氨酸氧化酶—LOX.(4)免疫共沉淀實(shí)驗檢測MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞在缺氧環(huán)境中表達(dá)的VEGF和LOX的相互作用。結(jié)果:(1)劃痕及侵襲實(shí)驗結(jié)果顯示:缺氧微環(huán)境賦予乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞更強(qiáng)的遷移、侵襲能力。(2)通過western blot技術(shù)對EMT標(biāo)記物的監(jiān)測發(fā)現(xiàn):缺氧環(huán)境中,與對照組相比,上皮標(biāo)記物—E-cadherin低表達(dá)。間質(zhì)標(biāo)記物—Vimentin高表達(dá),與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的金屬基質(zhì)蛋白酶9—MMP-9高表達(dá),同時對誘導(dǎo)EMT的受體酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)的PI3K-AKT通路中重要靶點(diǎn)PI3K和AKT進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)同時上調(diào),與對照組差異顯著。暗示缺氧誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是通過激活該通路實(shí)現(xiàn)的。(3)通過western blot和ELISA技術(shù)發(fā)現(xiàn),在缺氧環(huán)境中,血管內(nèi)皮生長因子和賴氨酸氧化酶同時高表達(dá),基于缺氧微環(huán)境和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移當(dāng)中的重要作用,二者分別作為缺氧誘導(dǎo)因子HIF下游的重要靶點(diǎn)和誘導(dǎo)EMT的受體酪氨酸激酶(RTKs/RPTK)家族中的關(guān)鍵分子,二者的表達(dá)量增加可能具有相關(guān)性。(4)免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗證血管內(nèi)皮生長因子和賴氨酸氧化酶在誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程的缺氧微環(huán)境中發(fā)揮了協(xié)同作用。使用二者的抑制劑有望在臨床上為抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移提供新思路。結(jié)論:缺氧微環(huán)境可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MDA-MB-231發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,使其具有更強(qiáng)的侵襲、遷移能力。該效應(yīng)是通過激活PI3K-AKT通路實(shí)現(xiàn)的。在缺氧環(huán)境下,血管內(nèi)皮生長因子和賴氨酸氧化酶同時高表達(dá),且二者之間具有相互作用,二者在缺氧微環(huán)境中可能協(xié)同作用促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 Zhao-ji LIU;Gregg L.SEMENZA;Hua-feng ZHANG;;低氧誘導(dǎo)因子與乳腺癌轉(zhuǎn)移(英文)[J];Journal of Zhejiang University-Science B(Biomedicine & Biotechnology);2015年01期

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本文編號：1282779