發(fā)布時間：2017-12-10 23:28

  本文關(guān)鍵詞：外源性HMGB1對放療后殘存人胰腺癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移的作用研究

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【摘要】：研究目的探究外源性高遷移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein,HMGB1)對放療后殘存人胰腺癌細胞系(SW1990、PANC-1)增殖和轉(zhuǎn)移的影響,并補充研究了外源性HMGB1對放療后裸鼠皮下瘤增殖的影響,初步探究外源性HMGB1引起放療后殘存胰腺癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。研究方法(1)ELISA實驗:將胰腺癌SW1990、PANC-1細胞分別接種于24孔板中,平均每孔1×105個細胞,每孔培養(yǎng)基定量至800μl,共10塊板,待細胞貼壁后分別將實驗設(shè)置:0Gy,4Gy,8Gy,10Gy以及12Gy共5組不同放療劑量。然后分別對10塊板給予相應(yīng)的放療劑量,繼續(xù)培養(yǎng)24h后依次將0Gy,4Gy,8Gy,10Gy及12Gy 5組不同放射劑量的細胞上清提取出來,后通過ELISA檢測法對不同放療劑量下細胞上清中HMGB1的表達量進行測定,并進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。(2)光學(xué)顯微鏡拍照:將胰腺癌SW1990、PANC-1細胞分別接種于24孔板中,大概每孔約1×105個細胞,共種4塊24孔板,待胰腺癌SW1990細胞貼壁后分為2組:0Gy及10Gy放射劑量進行照射;而胰腺癌Panc-1細胞貼壁后分為2組:0Gy及4Gy放射劑量進行照射。待放療結(jié)束后繼續(xù)將胰腺癌細胞放置于細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h,然后對4組細胞進行換液后,采用光學(xué)顯微鏡(Optical Microscope,OM)分別對4組細胞進行圖像采集。(3)劃痕實驗:將收集獲得的放療后殘存的胰腺癌SW1990、PANC-1細胞系分別接種于24孔板中,計數(shù)細胞約1.5×105細胞/孔,共6塊板,待放療后殘存細胞鋪滿整孔后進行劃痕,然后用PBS沖洗3遍后,將實驗分為三組:對照組(添加無血清培養(yǎng)基)、HMGB1組(添加含有100ng/m L HMGB1的無血清培養(yǎng)基)及HMGB1+EP組(添加含有100ng/m L HMGB1+100μmol EP的無血清培養(yǎng)基),共500μl培養(yǎng)基/孔,最后在光學(xué)顯微鏡下分別在0h,12h,24h時間點對2株細胞分別進行取樣拍照。(4)CFSE實驗:將收集獲得的放療后殘存胰腺癌SW1990細胞懸液及放療后殘存胰腺癌Panc-1細胞懸液并分別種于9塊培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待放療后殘存胰腺癌細胞貼壁后,將實驗共分為三組:對照組,HMGB1組及HMGB1+EP組。其中對照組在經(jīng)過換液后添加3m L DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);HMGB1組在經(jīng)過換液后添加3m L含100ng/m L HMGB1的DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);而HMGB1+EP組經(jīng)過換液后添加3m L含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的DMEM-F12有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。待3組培養(yǎng)皿于恒溫細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h后拿出進行處理,采用CFSE法分析三組處理對放療后殘存胰腺癌SW1990細胞及放療后殘存胰腺癌PANC-1細胞增殖的影響。(5)蛋白質(zhì)印記法(Western Blotting,WB)檢測:將收集獲得的放療后殘存胰腺癌SW1990細胞懸液及放療后殘存胰腺癌Panc-1細胞懸液并分別種于2個培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待放療后殘存胰腺癌細胞貼壁后,實驗分為兩組:對照組及HMGB1組。對照組殘存胰腺癌細胞大皿經(jīng)換液加入3m L有血清培養(yǎng)基;HMGB1組殘存胰腺癌細胞大皿經(jīng)換液后加入3m L含100ng/m L HMGB1的有血清培養(yǎng)基。將4組培養(yǎng)皿放置在恒溫恒濕的細胞培養(yǎng)箱中持續(xù)培育24h后取出,分別提蛋白;通過蛋白質(zhì)印跡法對通路蛋白GSK-3β、p-GSK,轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-CA、N-CA,增殖相關(guān)蛋白Ki67以及抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白質(zhì)表達情況進行測定。(6)體內(nèi)實驗:將胰腺癌SW1990細胞接種于9個培養(yǎng)皿(直徑10cm)中,待細胞融合度接近100%時將細胞消化離心至無菌EP管中,然后取200μl細胞懸液注射入裸鼠皮下,從而建立裸鼠胰腺癌皮下瘤模型,待模型建好后,同時將9只裸鼠進行放療,放療劑量為10Gy,隔日放療,連續(xù)3次,放療周期結(jié)束后,將9只裸鼠共分為三組:對照組3只、HMGB1組3只及HMGB1+EP組3只。其中對照組是向裸鼠皮下瘤四周注射0.9%的生理鹽水,約200μl;HMGB1組向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1的生理鹽水,約200μl;HMGB1+EP組向裸鼠皮下瘤四周注射含100ng/m L HMGB1+100μmol EP的生理鹽水,約200μl。在實驗過程中相隔2天用直尺測定皮下瘤的長徑及寬徑,從而利用公式計算皮下瘤的體積,最后并進行相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。研究結(jié)果(1)不同放療劑量(4Gy,8Gy,10Gy及12Gy)分別處理胰腺癌SW1990、Panc-1細胞后放療后上清中HMGB1的含量均較對照組(0Gy)增高;且放療劑量為4Gy時胰腺癌Panc-1細胞系培養(yǎng)上清中HMGB1含量最高,而放療劑量為10Gy時胰腺癌SW1990細胞系培養(yǎng)上清中HMGB1含量最高。(2)在正常無放療上清培養(yǎng)條件下,SW1990、PANC-1呈小梭形生長;在對胰腺癌Panc-1細胞進行4Gy放射治療以及對胰腺癌SW1990細胞進行10Gy放射治療后,繼續(xù)在放療上清培養(yǎng)條件下培養(yǎng),Panc-1及SW1990細胞均變大且觸角增多,細胞生長速度均變快。(3)劃痕實驗結(jié)果顯示HMGB1組放療后殘存胰腺癌細胞的遷移距離及遷移面積均較對照組及HMGB1+EP組明顯增加,而HMGB1+EP(HMGB1抑制劑)組放療后殘存胰腺癌細胞的遷移距離及遷移面積則較對照組明顯縮小。(4)CFSE結(jié)果顯示對照組、HMGB1組及HMGB1+EP組殘存胰腺癌SW1990細胞增殖率分別為:(43.6±2.1)%,(62.5±2.1)%及(33.2±1.7)%,殘存胰腺癌Panc-1細胞三組增殖率分別為:(37.5±0.9)%,(49±1.4)%及(29.3±1.3)%。實驗結(jié)果顯示:HMGB1組的細胞增殖率明顯高于其他兩組,且HMGB1+EP組的增殖率則較對照組降低。(5)Western blot實驗結(jié)果顯示HMGB1組放療后殘存胰腺癌細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白E-cadherin表達降低及N-cadherin表達增高;增殖相關(guān)蛋白Ki67及抗凋亡蛋白Bcl-2表達增高;且GSK-3β被激活,活化的p-GSK表達亦增高。(6)三組實驗分別在放療后的種植瘤周圍皮下注射200μl 0.9%生理鹽水,200μl HMGB1及200μl HMGB1+EP,結(jié)果發(fā)現(xiàn)瘤周注射含有EP(HMGB1抑制劑)的瘤體體積較對照組減小,結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論放療可以使HMGB1在放療上清中的表達增高,而外源性HMGB1可以促進放療后殘存人胰腺癌SW1990、Panc-1細胞增殖和遷移。外源性HMGB1上調(diào)Ki67、N-CA、p-GSK及Bcl-2的表達水平,下調(diào)E-CA的表達水平。外源性HMGB1抑制劑可抑制放療后裸鼠皮下瘤的增殖。外源性HMGB1可以促進放療后殘存人胰腺癌SW1990、PANC-1細胞轉(zhuǎn)移的機制可能與Wnt通路的激活及EMT的轉(zhuǎn)化有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.9

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 白雪莉;馬濤;梁廷波;;2016年NCCN胰腺癌臨床實踐指南(V1版)更新內(nèi)容解讀[J];中國實用外科雜志;2016年08期

2 項金峰;施思;梁丁孔;虞先o，

本文編號：1276323