本文關(guān)鍵詞：pH敏感逐級靶向納米載體的構(gòu)建及其用于遞送siRNA至M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究

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【摘要】：腫瘤免疫治療是指激發(fā)或調(diào)動機(jī)體的免疫系統(tǒng),增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答,從而控制和殺傷腫瘤免疫細(xì)胞,抑制腫瘤生長[1-3]。近年來,腫瘤免疫療法已發(fā)展成為繼手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)療法之后的第四種腫瘤治療模式。大多數(shù)實體瘤微環(huán)境中都伴有腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(Tumor-associated macrophages,TAMs),它們與腫瘤的生成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。TAMs可以分為Ml和M2兩種表型。Ml型TAMs可引起炎癥反應(yīng)、激活免疫反應(yīng),具有腫瘤抑制作用。M2型TAMs具有抗炎作用,且可促進(jìn)血管生成和組織重塑,抑制免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤的生成、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。由于腫瘤細(xì)胞分泌白介素-10、集落刺激因子(Colony Stimulating Factor,CSF-1)、轉(zhuǎn)化生長因子 β(Transforming-Growth Factor β,TGFβ 等,腫瘤部位大多數(shù)TAMs表現(xiàn)為M2表型。殺傷M2型TAMs或促進(jìn)M2型TAMs向M1表型的轉(zhuǎn)化成為基于M2型TAMs腫瘤免疫治療的有效手段。M2型TAMs成為腫瘤免疫治療的有效靶點(diǎn)。目前作用于M2型TAMs的藥物主要有單抗、小分子抑制劑和siRNA。其中,siRNA可以選擇性沉默靶基因,對基因進(jìn)行高度、特異性的調(diào)控,且具有特異性調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的潛能,可作用于M2型TAMs,發(fā)揮免疫療效。目前,一些研究構(gòu)建樹狀大分子、陽離子聚合物、膠束等載體用于siRNA的遞送,這些載體將M2型TAMs的靶向因子修飾于載體表面,從而發(fā)揮主動靶向作用。但是由于巨噬細(xì)胞分布范圍廣,將siRNA遞送至其他正常組織的M2型巨噬細(xì)胞,可能會引起免疫系統(tǒng)破壞等毒副作用。因此,設(shè)計一種載體以增加siRNA在M2型TAMs的積累,減少siRNA在正常組織的分布,具有十分重要的意義。本課題構(gòu)建pH敏感逐級靶向納米載體通過組織透過性增強(qiáng)及滯留效應(yīng)(enhanced permeation and retention effect,EPR effect)和轉(zhuǎn)胞吞作用的雙重一級靶向作用,到達(dá)腫瘤組織,增加納米載體在腫瘤部位的蓄積;pH敏感一級靶向材料在腫瘤部位脫落,暴露二級靶向內(nèi)核,靶向M2型TAMs,將siRNA特異性遞送至M2型TAMs。本課題選擇靶向肽天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(asparagines-glycine-arginine,NGR)作為一級靶向因子,羧甲基殼聚糖(O-carboxymethyl-chitosan,CMCS)作為pH敏感材料,以聚乙二醇[poly(ethylene glycol),PEG]為連接,合成pH敏感一級靶向材料CMCS-PEG-NGR(CPN);選取甘露糖作為二級靶向因子,聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)作為基因壓縮材料,合成α-D吡喃甘露糖基苯基異硫氰酸酯(α-D-Mannopyranosylphenyl,MPITC)-PEI(M-PEI)作為二級靶向材料。M-PEI壓縮siRNA形成表面荷正電的二級靶向內(nèi)核M-PEI/siRNA(MPR),通過靜電作用吸附在生理條件下(pH 7.4)荷負(fù)電的CPN,構(gòu)成pH敏感逐級靶向納米載體CPN/M-PEI/siRNA(CMPR)。本課題選取siR-RiboTM Negative Control 作為模型基因制備 PEI/siRNA(PR)、MPR、CPN/PEI/siRNA(CPR)和CMPR,篩選處方并對最優(yōu)處方進(jìn)行理化性質(zhì)評價,考察其穩(wěn)定性、細(xì)胞攝取及分布,對CPN的pH敏感性進(jìn)行驗證,考察MPR、CMPR的體內(nèi)靶向性,對PR、MPR、CPR、CMPR的體內(nèi)安全性進(jìn)行初步評價。主要研究方法和結(jié)果包括:第一章一級靶向納米載體的構(gòu)建及其理化性質(zhì)研究本章合成pH敏感一級靶向材料CPN,以siR-RiboTM Negative Control為模型基因,采用室溫孵育的方法制備PR及CPR。采用瓊脂糖凝膠電泳對PEI壓縮siRNA的能力及CPN靜電吸附形成CPR的情況進(jìn)行考察,確定最優(yōu)處方;采用透射電鏡觀察PR、CPR的形態(tài),Malvern粒度電位分析儀測定其粒徑、粒度分布及電位;最后采用瓊脂糖凝膠電泳對PR、CPR抗RNaseA能力及血清穩(wěn)定性進(jìn)行考察。實驗結(jié)果表明,CPN的核磁共振氫譜(Nuclear Magnetic Resonance,1H NMR)出現(xiàn)CMCS、PEG、NGR特征峰,確證CPN的成功合成;PR的最優(yōu)處方為PEI與siRNA質(zhì)量比為2:1,CPR最優(yōu)處方為CPN與siRNA質(zhì)量比為4:1,最優(yōu)處方工藝制備的PR和CPR形態(tài)較為圓整,均成球形或類球形,平均粒徑分別為83.7±4.9nm 和 154.5±2.1 nm,平均電位分別為 20.97±1.53mV 和-14.10±0.90mV,多分散系數(shù)均小于0.2;在12 h內(nèi),PR、CPR對siRNA具有一定的保護(hù)能力,可以保護(hù)siRNA免受RNase A的降解及血清成分的破壞。第二章pH敏感逐級靶向納米載體的構(gòu)建及其理化性質(zhì)研究本章合成二級靶向材料M-PEI,以siR-RiboTM Negative Control為模型基因,采用室溫孵育的方法制備MPR及CMPR。采用瓊脂糖凝膠電泳對M-PEI壓縮siRNA的能力及CPN靜電吸附形成CMPR的情況進(jìn)行考察,確定最優(yōu)處方;采用透射電鏡觀察MPR、CMPR的形態(tài),Malvern粒度電位分析儀測定其粒徑、粒度分布及電位;采用瓊脂糖凝膠電泳對MPR、CMPR抗RNase A能力及血清穩(wěn)定性進(jìn)行考察;采用Malvern粒度電位分析儀對MPR、CMPR的存儲穩(wěn)定性及血漿穩(wěn)定性進(jìn)行考察;建立siRNA在不同pH PBS中的測定方法,采用動態(tài)膜透析法對siRNA的釋放行為進(jìn)行考察;采用酸堿滴定法測定CPN的等電點(diǎn)。實驗結(jié)果表明,M-PEI的1H NMR圖譜出現(xiàn)MPITC、PEI的特征峰,確證M-PEI 成功合成,傅里葉變換紅外光譜(Fourier Transform Infrared Spectroscopy,FTIR)進(jìn)一步驗證M-PEI的合成;MPR的最優(yōu)處方為M-PEI與siRNA質(zhì)量比為2:1,CMPR最優(yōu)處方為CPN與siRNA質(zhì)量比為4:1,最優(yōu)處方工藝制備的MPR和CMPR形態(tài)較為圓整,均成球形或類球形,平均粒徑分別為93.2±4.1 nm和146.4±6.9 nm,平均電位分別為16.40±0.92 mV和-17.00±0.10 mV,多分散系數(shù)均在0.2左右;在12 h內(nèi),MPR、CMPR對siRNA具有一定的保護(hù)能力,可以保護(hù)siRNA免受RNase A的降解及血清成分的破壞,在血漿中CMPR比MPR具有更高的穩(wěn)定性;體外釋放結(jié)果顯示在pH 5.0和pH 6.5條件下siRNA從CMPR中的累計釋放量顯著高于pH 7.4條件,siRNA從CMPR中的釋放具有一定的pH敏感性;CPN的等電點(diǎn)為6.33。第三章pH敏感逐級靶向納米載體的體內(nèi)、外靶向性評價及初步安全性評價本章以F4/80抗體標(biāo)記巨噬細(xì)胞,以CD206抗體標(biāo)記M2型TAMs,以Cy3和Cy5標(biāo)記的siR-RiboTM Negative Control作為模型基因,對PR及MPR的細(xì)胞攝取進(jìn)行考察。采用激光共聚焦顯微鏡對PR、MPR在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上的攝取進(jìn)行觀察和定量,對siRNA及CD206進(jìn)行共定位及定量分析;對MPR在小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上的競爭性攝取進(jìn)行觀察和定量分析;對CMPR在pH 6.5、pH 7.4培養(yǎng)基條件下的攝取進(jìn)行觀察和定量分析;采用小鼠活體成像的方法對CMPR在小鼠的體內(nèi)分布進(jìn)行觀察和定量分析;采用免疫熒光技術(shù)觀察小鼠腫瘤組織冰凍切片,對PR、MPR、CMPR在腫瘤組織中的細(xì)胞攝取情況進(jìn)行考察;采用溶血實驗對PR、MPR、CPR、CMPR的溶血情況進(jìn)行考察;最后對給藥小鼠組織進(jìn)行HE染色評價PR、MPR、CPR和CMPR的初步安全性。細(xì)胞攝取實驗結(jié)果顯示,細(xì)胞與PR、MPR孵育1 h、4h后,M2型TAMs對PR、MPR的攝取無明顯差異(p0.1);競爭性抑制實驗結(jié)果顯示,在未經(jīng)游離甘露糖孵育的細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞與MPR孵育1 h后,siRNA與CD206的共定位效率為事先與游離甘露糖孵育細(xì)胞中共定位效率的1.63倍,存在一定差異(p0.05),表明MPR可通過M2型TAMs表面CD206受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞,細(xì)胞與MRP孵育4h后,二者共定位效率無明顯差異(p0.3);在pH6.5條件下,siRNA與CD206共定位效率為pH7.4條件下的1.40倍,存在顯著差異(p0.01),表明CPN可在pH 6.5條件下響應(yīng)性脫落;小鼠活體成像結(jié)果顯示,CMPR組在腫瘤組織的平均熒光強(qiáng)度是游離siRNA組的4.65倍,表明CMPR可增加siRNA在腫瘤組織的蓄積;腫瘤組織冰凍切片實驗結(jié)果表明CMPR可增加siRNA在M2型TAMs中的蓄積,MPR可特異性靶向M2型TAMs;溶血實驗結(jié)果顯示,PR、MPR、CPR、CMPR均不會引起溶血現(xiàn)象,可靜脈注射;小鼠給予PR、MPR、CPR、CMPR后,對小鼠組織進(jìn)行HE染色觀察發(fā)現(xiàn),各組織器官與生理鹽水組比較無顯著差異,無明顯病理變化。上述實驗結(jié)果表明,CMPR可增加siRNA在腫瘤組織的蓄積,CPN可在腫瘤組織微酸性條件下響應(yīng)性脫落,MPR可通過M2型TAMs表面CD206受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑入胞。PR、MPR、CPR、CMPR具有良好的初步安全性。本課題以CPN作為pH敏感一級靶向材料,M-PEI作為二級靶向材料,構(gòu)建pH敏感型逐級靶向納米載體CMPR。CMPR可通過一級靶向增加載體在腫瘤組織的蓄積,通過二級靶向增強(qiáng)M2型TAMs中siRNA的蓄積。CMPR具有良好的穩(wěn)定性和初步安全性,具有進(jìn)一步開發(fā)的巨大潛力,為開發(fā)siRNA向M2型TAMs的遞送載體提供了新思路、新方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R730.51

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本文編號：1270592