本文關(guān)鍵詞：TSA預(yù)處理對(duì)hUC-MSCs神經(jīng)分化以及干細(xì)胞治療TBI的促進(jìn)作用

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【摘要】：近年來,神經(jīng)功能的修復(fù)是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是一種神經(jīng)功能遭受嚴(yán)重破壞的疾病。由于自身神經(jīng)功能修復(fù)有限,TBI帶來的神經(jīng)功能損害常常會(huì)導(dǎo)致殘疾甚至死亡。利用干細(xì)胞的分化特性來修復(fù)受損功能是再生醫(yī)學(xué)研究的重要策略,干細(xì)胞的研究經(jīng)常受到倫理爭議和來源的限制,一定程度上阻礙了其在功能修復(fù)疾病研究中的應(yīng)用。因此,我們采用人臍帶源性間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cell,hUC-MSCs)作為研究對(duì)象,hUC-MSCs具有分化成神經(jīng)細(xì)胞的潛力、來源廣泛以及倫理爭議少等優(yōu)點(diǎn),在臨床上具有很大的應(yīng)用價(jià)值。利用干細(xì)胞移植來治療TBI已經(jīng)取得一定的成效,但是在病灶區(qū)干細(xì)胞遷移數(shù)量少和分化效率低,極大的阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。因此,如何提高干細(xì)胞的遷移數(shù)量和分化效率成為干細(xì)胞治療TBI的關(guān)鍵。干細(xì)胞定向遷移至病灶區(qū)主要由SDF-1/CXCR4反應(yīng)軸來介導(dǎo),研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙�；�(HDAC)的抑制劑,能夠使干細(xì)胞表面CXCR4的表達(dá)水平上調(diào)。研究還發(fā)現(xiàn),組蛋白乙�；梢哉{(diào)控干細(xì)胞的增殖和分化,利用HDAC的抑制劑能夠促進(jìn)干細(xì)胞的成神經(jīng)分化。近期研究發(fā)現(xiàn),組蛋白H3亞基賴氨酸殘基的乙酰化(H3K9Ac)在維持干細(xì)胞多能性和成神經(jīng)細(xì)胞分化中具有積極的作用。曲古抑菌素A(TSA)是HDAC的一種廣譜抑制劑,國內(nèi)外很多文獻(xiàn)報(bào)道TSA能夠抑制Ⅰ型和Ⅱ型HDAC的活性并使H3K9Ac的表達(dá)量升高,并且有文獻(xiàn)報(bào)道TSA能夠促進(jìn)多種干細(xì)胞向其它細(xì)胞的分化。但是,TSA預(yù)處理是否能夠促進(jìn)hUC-MSCs的成神經(jīng)分化還未知。TSA預(yù)處理hUC-MSCs后移植對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用尚未見報(bào)道。因此,我們推測TSA處理hUC-MSCs后有可能會(huì)促進(jìn)hUC-MSCs向病灶區(qū)的遷移和成神經(jīng)分化,進(jìn)而提高h(yuǎn)UC-MSCs移植治療TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)效果。目的通過體外實(shí)驗(yàn)研究TSA預(yù)處理后對(duì)hUC-MSCs增殖、凋亡、遷移以及成神經(jīng)分化的影響;體內(nèi)實(shí)驗(yàn)通過建立C57BL/6J小鼠的TBI模型,研究TSA預(yù)處理的hUC-MSCs移植對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)效果的影響,為進(jìn)一步探討乙酰化在干細(xì)胞遷移和成神經(jīng)分化中的相關(guān)分子機(jī)制提供基礎(chǔ)。方法第一部分、TSA對(duì)hUC-MSCs的增殖、分化、遷移以及成神經(jīng)分化的影響1.分組:將實(shí)驗(yàn)分為2組:對(duì)照組(MSCs組)和TSA處理組(TSA-MSCs組)。2.流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測TSA對(duì)hUC-MSCs周期和凋亡的影響。3.Western Blot檢測細(xì)胞膜上CXCR4的表達(dá)量,Transwell檢測SDF-1的靶向遷移能力。4.Western Blot檢測TSA處理后細(xì)胞H3K9Ac和HDAC1的表達(dá)量;體外誘導(dǎo)成神經(jīng)分化后,q RT-PCR檢測NSE、DCX的相對(duì)表達(dá)量。第二部分、TSA處理的hUC-MSCs對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用1.利用立體定位儀將81只C57BL/6J建立TBI模型,隨機(jī)分為3組:生理鹽水組(Veh組)、hUC-MSCs移植組(MSCs組)、TSA處理的hUC-MSCs移植組(TSA+MSCs組),每組27只。2.q RT-PCR檢測各組病灶區(qū)SDF-1的表達(dá)情況,免疫組化檢測病灶區(qū)人源細(xì)胞,初步判斷hUC-MSCs的遷移情況。3.統(tǒng)計(jì)體重評(píng)估小鼠的身體綜合狀況;神經(jīng)損傷評(píng)分(Neurologic deficit score,NDS)和掛線實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的運(yùn)動(dòng)功能、糖水偏好實(shí)驗(yàn)檢測小鼠的憂郁程度、新事物識(shí)別檢測小鼠的認(rèn)知能力;Morris水迷宮檢測小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力。4.干濕重法檢測損傷側(cè)的腦含水量;CV染色評(píng)估腦損傷體積;PI檢測小鼠病灶區(qū)壞死神經(jīng)元;Western Blot檢測凋亡相關(guān)的Caspase3-Cleaved、Bcl2的表達(dá)情況。5.Ellisa檢測炎癥相關(guān)的IL-4、IL-10、IL-1β、TNF-α,氧化應(yīng)激相關(guān)的SOD、GSH、GSH-Px和MDA的表達(dá)量。6.Western Blot檢測病灶區(qū)乙�；嚓P(guān)的HDAC1和H3K9Ac的相對(duì)表達(dá)情況;q RT-PCR檢測神經(jīng)元標(biāo)記物DCX、MAP2和神經(jīng)生長因子BDNF、NGF、NT3的相對(duì)表達(dá)情況;免疫熒光檢測腦組織中DCX、Neu N的表達(dá)情況。結(jié)果第一部分、TSA對(duì)hUC-MSCs的增殖、分化、遷移以及成神經(jīng)分化的影響1.Western Blot和流式結(jié)果顯示,與MSCs組相比,TSA-MSCs組的凋亡情況無顯著差異,細(xì)胞被阻滯在G1/S期(P0.05)。2.Western Blot檢測,與MSCs組相比,TSA處理后hUC-MSCs膜上的CXCR4表達(dá)量上調(diào),差異顯著(P0.05);Transwell結(jié)果顯示,TSA-MSCs組細(xì)胞靶向SDF-1的遷移數(shù)量明顯增多(P0.05)。3.乙�；綑z測結(jié)果顯示,TSA-MSCs組較MSCs組乙酰化相關(guān)的HDAC1的表達(dá)下調(diào),H3K9Ac的表達(dá)上調(diào)(P0.05);與MSCs組相比,TSA-MSCs組的神經(jīng)元標(biāo)記物DCX和NSE表達(dá)明顯升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。第二部分、TSA處理的hUC-MSCs對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用1.各組在病灶區(qū)SDF-1的表達(dá)情況無顯著差異,TSA+MSCs組和MSCs組均能檢測到人源細(xì)胞的存在,與MSCs組相比,初步推斷TSA+MSCs組在病灶區(qū)檢測到的人源細(xì)胞數(shù)目更多。2.在體重監(jiān)測、NDS評(píng)分、掛線、糖水偏好、新物體識(shí)別和水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中,與Veh組相比,細(xì)胞移植治療組均明顯改善小鼠的運(yùn)動(dòng)能力、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力、憂郁程度,TSA+MSCs組的改善效果更佳(P0.05)。3.與Veh組相比,細(xì)胞移植治療組小鼠的損傷側(cè)半球腦含水量明顯降低、腦損傷體積減小、病灶區(qū)壞死細(xì)胞數(shù)減少,凋亡相關(guān)蛋白Bcl2的表達(dá)上升,Caspase3-cleaved的表達(dá)下降。TSA+MSCs組的表現(xiàn)更佳(P0.05)。4.與Veh組相比,細(xì)胞移植治療組炎癥相關(guān)因子IL-4和IL-10表達(dá)上升,IL-1β和TNF-α的表達(dá)量降低,氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA的表達(dá)量下降,自由基清除物質(zhì)SOD、GSH、GSH-Px下調(diào),除IL-1β外,TSA+MSCs組上調(diào)和下降更明顯(P0.05)。5.與Veh組相比,TSA+MSCs組與MSCs組HDAC1的表達(dá)量明顯下調(diào),H3K9Ac的表達(dá)顯著升高,TSA+MSCs組差異更明顯(P0.05);神經(jīng)生長因子BNDF、NT3、NGF和神經(jīng)元標(biāo)記物DCX、Neu N、MAP2表達(dá)量均明顯上調(diào),TSA+MSCs組上調(diào)更顯著(P0.05)。結(jié)論1.TSA處理后的hUC-MSCs,乙�；缴�,同時(shí),細(xì)胞周期受到抑制,凋亡無顯著變化,TSA可以促進(jìn)hUC-MSCs膜上CXCR4的表達(dá),向SDF-1的遷移增加;上調(diào)神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物DCX和NSE的表達(dá),促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的分化。2.TSA處理后的MSCs可以遷移到TBI小鼠病灶區(qū)中,并提高病灶區(qū)的乙�；�,改善小鼠的行為能力、減輕腦水腫、減小病灶區(qū)的壞死細(xì)胞數(shù)、減緩炎癥,促進(jìn)MSCs在病灶區(qū)的神經(jīng)再生能力,進(jìn)而改善MSCs移植對(duì)TBI小鼠的神經(jīng)修復(fù)作用。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R651.15

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1 王海燕;蘇冠方;徐春玲;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化條件及分化機(jī)制[J];眼科新進(jìn)展;2009年12期

2 劉海英,張慶俊,趙宗茂;人臍血干細(xì)胞的特性及其神經(jīng)分化的研究進(jìn)展[J];河北醫(yī)藥;2004年02期

3 王翠琴;張廣宇;彭越;彭濤;賈延R，

本文編號(hào)：1255742