發(fā)布時間：2017-10-08 18:24

  本文關鍵詞：Bacillus licheniformis角蛋白酶的高效表達、熱穩(wěn)定性及底物特異性改造

  更多相關文章： 角蛋白酶 地衣芽胞桿菌 熱穩(wěn)定性 底物特異性 前導肽

【摘要】：角蛋白酶是種特殊的可以降解角蛋白的蛋白酶類，其在飼料、織物處理、清潔劑、醫(yī)藥等行業(yè)具有廣泛的應用價值。本論文篩選到株對羊毛具有明顯降解作用的地衣芽胞桿菌（Bacillus licheniformis BBE11-1），通過對表達宿主、調控元件和產酶條件進行優(yōu)化提高了角蛋白酶基因ker的表達量。隨后對重組角蛋白酶的酶學性質進行了研究，并在此基礎上通過分子改造提高了重組角蛋白酶的熱穩(wěn)定性和對α-角蛋白的底物特異性，主要研究結果包括： （1）篩選到株對羊毛具有明顯降解作用的地衣芽孢桿菌（B. licheniformis BBE11-1）。將其角蛋白酶基因ker分別在大腸桿菌、枯草芽孢桿菌以及畢赤酵母中實現(xiàn)了胞外分泌表達。通過優(yōu)化誘導劑IPTG和酵母粉濃度，角蛋白酶在大腸桿菌中的胞外酶活最高達到350U·mL-1。通過碳源和金屬離子的優(yōu)化，枯草桿菌重組菌B. subtilisWB600/pMA5-ker的胞外酶活最高達到386U·mL-1。而重組畢赤酵母pPIC9K-ker/P.pastoris GS115在甲醇誘導濃度為10g·L-1時，重組角蛋白酶的酶活最高可達285U·mL-1，重組角蛋白酶為經過糖基化修飾的蛋白。在此基礎上，分別對重組菌B.subtilis WB600/pMA5-ker、 B. subtilis WB600/pSTOP1622-ker和P. pastorisGS115/pPIC9K-ker在3L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵產酶研究，結果發(fā)現(xiàn)B. subtilisWB600/pSTOP1622-ker可以達到較好的產酶效果，酶活最高可達1840U·mL-1。 （2）對三種重組角蛋白酶進行了純化與酶學性質研究。重組角蛋白酶的最適反應pH為10，在堿性環(huán)境（pH8-11）具有較好的穩(wěn)定性。KerE（大腸桿菌重組酶），KerB（枯草芽孢桿菌重組酶）和KerP（畢赤酵母重組酶）的最適反應溫度分別為50，40和70℃。KerE和KerB的熱穩(wěn)定性較差，而KerP的熱穩(wěn)定性則較好。重組酶為絲氨酸蛋白酶，，對金屬離子、螯合劑和抑制劑呈現(xiàn)出相同的反應趨勢。同時，重組酶在表面活性劑及H2O2存在的條件下穩(wěn)定性較好。KerB的米氏常數（Km）為2.42mmol·L-1，最大反應速率（Vmax）為35.84mmol·min-1，催化常數（kcat）和專性常數（kcat/Km）分別為22.61s-1和9.34L·(s·mmol)-1。當采用混合酶體系（1%OWF Savinase和60%OWF角蛋白酶）處理羊毛纖維1h后可以達到較好的防氈縮效果，而單獨采用60%OWF角蛋白酶處理羊毛纖維36h后同樣可以取得較好的防氈縮效果，同時纖維強度的損失也小于雙酶處理方法。 （3）分別通過B-FITTER、PoPMuSiC軟件預測以及NAMD分子動力學模擬識別角蛋白酶的不穩(wěn)定區(qū)域，與同源比對分析相結合，分別構建了12株突變體。驗證獲得四正效應的突變體N122Y、N217S、A193P和N160C。其中突變體N122Y在60℃條件下的t1/2值由9min提高到23min，催化活力（kcat/Km）與野生型相比提高了5.6倍。對四個正效應突變點進行了組合突變，獲得的組合突變體展現(xiàn)了較好的協(xié)同效應，在60℃條件下的t1/2值較野生型提高了8.6倍。對突變體提高熱穩(wěn)定性的原因分析顯示，突變體較野生型主要增加了6對疏水相互作用力，1對cation-pi作用力以及11對氫鍵作用力，其中N122Y提供了3對疏水相互作用力。 （4）為了提高角蛋白酶對ɑ-角蛋白（羊毛鱗片）的底物特異性，通過定點突變對角蛋白酶底物結合區(qū)域S1及S4進行了改造。結果表明，縮小S1和S4底物結合區(qū)域會降低角蛋白酶對酪蛋白及ɑ-角蛋白的活力，說明底物結合區(qū)域的大小對角蛋白酶對ɑ-角蛋白的特異性影響較大。而以合適的構象增大S4底物結合區(qū)域（M134A）雖然降低了角蛋白酶對酪蛋白的活性，卻會增加其對ɑ-角蛋白的活力。通過氨基酸分析、XPS表面元素和動力學分析發(fā)現(xiàn)，突變體M134A對ɑ-角蛋白的特異性增強很可能是由于其增加了對羊毛鱗片蛋白中的Lys、Cys和Asp的親和性。對突變體酶的羊毛織物防氈縮效果進行評估，結果證明突變體M134A較野生型角蛋白酶具有更好的羊毛織物防氈縮效果。 （5）對蛋白酶前導肽切割區(qū)域進行改造。結果發(fā)現(xiàn)在角蛋白酶前導肽切割位點的P1位置引入Ala殘基可以促進成熟酶的胞外分泌，而前導肽C端結構的變化會影響成熟酶的胞外分泌。缺失或替換角蛋白酶的N端會大幅度降低酶活力，說明其結構對于角蛋白酶成熟酶的有效分泌是必須的。將角蛋白酶N端AQTVP替換為Thermoactinomyces vulgaris來源的嗜熱蛋白酶的N端YTPNDPYFSSRQ可以有效的提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性，在60℃條件下的t1/2值由9min提高到20min。同時，考察了葡萄糖流加速率和誘導菌體密度對重組菌B. subtilis WB600/pSTOP1622-ker在3L發(fā)酵罐上發(fā)酵產酶的影響，當在分批發(fā)酵6h后以6g·(L·h)-1恒速流加葡萄糖15h，誘導菌體密度（OD600）為15時產酶效果最佳，酶活最高可以達到3017U·mL-1，為目前報道的最高值。
【關鍵詞】：角蛋白酶 地衣芽胞桿菌 熱穩(wěn)定性 底物特異性 前導肽
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 目錄7-11
• 第一章 緒論11-24
• 1.1 角蛋白及角蛋白酶概述11-19
• 1.1.1 角蛋白簡介11
• 1.1.2 角蛋白酶的分類11-12
• 1.1.3 角蛋白酶的理化性質12-15
• 1.1.4 角蛋白酶的結構和底物特異性15-16
• 1.1.5 角蛋白酶的發(fā)酵優(yōu)化16
• 1.1.6 角蛋白酶的克隆表達及分子改造16-18
• 1.1.7 角蛋白酶的主要應用18-19
• 1.2 提高蛋白質熱穩(wěn)定性的策略19-22
• 1.2.1 非理性設計20
• 1.2.2 理性設計20-22
• 1.3 立項依據和研究意義22
• 1.4 本論文的主要研究內容22-24
• 第二章 產角蛋白酶菌株的篩選及角蛋白酶基因的異源表達24-43
• 2.1 前言24
• 2.2 材料與方法24-30
• 2.2.1 質粒、菌株和引物24-25
• 2.2.2 試劑及儀器25-26
• 2.2.3 培養(yǎng)基26-27
• 2.2.4 菌種篩選方法27
• 2.2.5 DNA 操作方法27-28
• 2.2.6 培養(yǎng)條件28-29
• 2.2.7 分析方法29-30
• 2.3 結果與討論30-41
• 2.3.1 產角蛋白酶菌株的篩選30
• 2.3.2 菌株的遺傳學鑒定30-32
• 2.3.3 ker 基因的克隆與分析32-33
• 2.3.4 ker 基因在大腸桿菌中的表達33-34
• 2.3.5 IPTG 和酵母粉濃度對重組角蛋白酶在大腸桿菌中分泌表達的影響34-35
• 2.3.6 ker 基因在枯草芽孢桿菌中的表達35-37
• 2.3.7 碳源和金屬離子對重組角蛋白酶在枯草芽孢桿菌中分泌表達的影響37-38
• 2.3.8 ker 基因在畢赤酵母中的表達38-39
• 2.3.9 重組 B. subtilis WB600 的分批發(fā)酵39-40
• 2.3.10 重組 P. pastoris GS115 的高密度發(fā)酵40-41
• 2.4 本章小結41-43
• 第三章 重組角蛋白酶的酶學性質研究與應用效果評價43-53
• 3.1 前言43
• 3.2 材料與方法43-45
• 3.2.1 菌株43
• 3.2.2 儀器與試劑43-44
• 3.2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件44
• 3.2.4 重組酶的分離純化44
• 3.2.5 羊毛防氈縮處理44
• 3.2.6 分析方法44-45
• 3.3 結果與討論45-51
• 3.3.1 重組角蛋白酶的純化45-46
• 3.3.2 重組角蛋白酶的最適反應 pH 和 pH 穩(wěn)定性46-47
• 3.3.3 重組角蛋白酶的最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性47-48
• 3.3.4 金屬離子、螯合劑及不可逆抑制劑對角蛋白酶酶活的影響48
• 3.3.5 表面活性劑、還原劑，漂白劑對角蛋白酶穩(wěn)定性的影響48-49
• 3.3.6 K:C 值的測定49-50
• 3.3.7 重組角蛋白酶的動力學參數測定50
• 3.3.8 角蛋白酶對羊毛防氈縮應用效果評估50-51
• 3.4 本章小結51-53
• 第四章 計算機輔助分析提高角蛋白酶的熱穩(wěn)定性53-65
• 4.1 前言53
• 4.2 材料與方法53-55
• 4.2.1 菌株53
• 4.2.2 儀器與試劑53
• 4.2.3 DNA 操作53-54
• 4.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件54
• 4.2.5 晶體結構模型的構建及結構分析54
• 4.2.6 不穩(wěn)定區(qū)域的預測54-55
• 4.2.7 野生型與突變體角蛋白酶的純化55
• 4.2.8 分析方法55
• 4.3 結果與討論55-64
• 4.3.1 角蛋白酶三維結構的模擬55-56
• 4.3.2 突變位點的預測56-59
• 4.3.3 突變對角蛋白酶活力的影響59-60
• 4.3.4 突變對角蛋白酶熱穩(wěn)定性的影響60-61
• 4.3.5 突變體的結構模擬及分析61-63
• 4.3.6 突變對角蛋白酶催化活力的影響63-64
• 4.4 本章小結64-65
• 第五章 角蛋白酶底物結合區(qū)域的分析與改造65-73
• 5.1 前言65
• 5.2 材料與方法65-67
• 5.2.1 菌株65
• 5.2.2 儀器與試劑65-66
• 5.2.3 DNA 操作66
• 5.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件66
• 5.2.5 晶體結構模型的構建及結構分析66
• 5.2.6 野生型與突變體角蛋白酶的純化66
• 5.2.7 分析方法66-67
• 5.3 結果與討論67-71
• 5.3.1 突變體對角蛋白酶底物特異性的影響67-69
• 5.3.2 突變體對羊毛鱗片降解的氨基酸分析69-70
• 5.3.3 突變體角蛋白酶的動力學分析70
• 5.3.4 突變體角蛋白酶的羊毛織物防氈縮效果評估70-71
• 5.4 本章小結71-73
• 第六章 角蛋白酶前導肽切割區(qū)域的分析與改造73-89
• 6.1 前言73-74
• 6.2 材料與方法74-76
• 6.2.1 菌株74
• 6.2.2 儀器與試劑74
• 6.2.3 DNA 操作74-75
• 6.2.4 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件75-76
• 6.2.5 晶體結構模型的構建及結構分析76
• 6.2.6 野生型與突變體角蛋白酶的純化76
• 6.2.7 分析方法76
• 6.3 結果與討論76-87
• 6.3.1 前導肽切割位點 Leu(P1)對成熟酶胞外分泌的影響76-78
• 6.3.2 前導肽 C 端對成熟酶胞外分泌的影響78-79
• 6.3.3 成熟酶 N 端對其活力的影響79-83
• 6.3.4 組合突變體的酶學性質檢測83
• 6.3.5 恒速流加對 B. subtilis 發(fā)酵產酶的影響83-86
• 6.3.6 誘導菌體密度對 B. subtilis 發(fā)酵產酶的影響86-87
• 6.4 本章小結87-89
• 主要結論與展望89-92
• 主要結論89-91
• 展望91-92
• 論文創(chuàng)新點92-93
• 致謝93-95
• 參考文獻95-106
• 附錄 作者在攻讀博士學位期間發(fā)表的論文106

【共引文獻】

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本文編號：995579