本文關(guān)鍵詞：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中microRNA介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)

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【摘要】：目的：前期,我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)確證了建立一定的共培養(yǎng)條件可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為汗腺樣細(xì)胞。但其中關(guān)鍵的基礎(chǔ)科學(xué)問題并沒有完全解決,本研究的主要目的是,利用microRNA新技術(shù),尋找MSCs分化為汗腺樣細(xì)胞過程中的關(guān)鍵microRNA及其介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)控,并驗(yàn)證microRNA細(xì)胞生物功能。方法：前期研究表明,EDA-A1能促進(jìn)正常和外胚層發(fā)育缺陷小鼠的汗腺、毛囊等外胚層組織器官的發(fā)育,EGF能提高M(jìn)SCs分化為SGLCs的誘導(dǎo)率。因此,本文采用1μg/ml EDA-A1、50 ng/ml EGF以及汗腺熱休克損傷微環(huán)境,通過transwell間接培養(yǎng)板,誘導(dǎo)MSCs分化為SGLCs。然后通過microRNA基因芯片檢測(cè),分析MSCs誘導(dǎo)前后,以及正常汗腺的microRNA差異表達(dá)譜,其中發(fā)生極其顯著改變的microRNAs被篩選出來,通過生物信息學(xué)進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),其中直接靶向與汗腺發(fā)育、干細(xì)胞分化相關(guān)基因的microRNAs:has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p被進(jìn)一步篩選出來。利用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑分別將synthetic has-miR-138-5p mimics (inhibitor)-cy3、synthetic has-miR-146a-5p mimics (inhibitor)-cy3和synthetic microRNA mimics (inhibitor) negative control-cy3轉(zhuǎn)染MSCs,進(jìn)行靶基因驗(yàn)證,分析其參與的信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò),并進(jìn)一步驗(yàn)證其生物功能。結(jié)果：通過間接誘導(dǎo)模型,誘導(dǎo)10d后,transwell培養(yǎng)板上層的MSCs,部分形態(tài)由“長(zhǎng)梭形”變?yōu)椤安灰?guī)則橢圓形或多邊形”,局部呈現(xiàn)“鋪路石”樣結(jié)構(gòu)。進(jìn)行免疫熒光檢測(cè),結(jié)果顯示大部分誘導(dǎo)后的細(xì)胞CEA、CK19、CK7、CK8和CK14表達(dá)陽性,說明部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后表型轉(zhuǎn)換為汗腺樣細(xì)胞。MicroRNA表達(dá)譜的差異比對(duì)結(jié)果顯示,SGLCs VS MSCs,19 microRNAs上調(diào),49 microRNAs下調(diào);SGCs VS MSCs,120 microRNAs上調(diào),59 microRNAs下調(diào)。為了縮小研究范圍,我們?nèi)GLCs VS MSCs和SGCs VS MSCs的交集,結(jié)果37 microRNAs在以上兩個(gè)比對(duì)中均出現(xiàn),其中12 microRNAs上調(diào),25 microRNAs下調(diào)。通過生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè),我們發(fā)現(xiàn)該37個(gè)microRNAs：與汗腺發(fā)育和干細(xì)包分化的一系列因子相關(guān),例如靶向細(xì)胞因子CEA、KRT、EDA以及參與信號(hào)通路EDA/EDAR、NF-κB、Wnt、ERK等的調(diào)節(jié)。其中has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p.均直接靶向NE-κB信號(hào)通路相關(guān)的多個(gè)基因。MicroRNAs轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后,熒光顯微鏡下觀察,大部分細(xì)胞胞漿顯示飽和的紅色熒光,流式結(jié)果亦顯示轉(zhuǎn)染效率為98.56%. RT-PCR結(jié)果顯示,has-miR-138-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs 48 h后,h-KRT19、h-NFKB1、h-RELA和h-RELB的表達(dá)顯著增高,但轉(zhuǎn)染前后均不表達(dá)h-KRT16, has-miR-138-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后,h-NFKB1、h-RELA和h-RELB表達(dá)顯著降低。另,has-miR-146a-5p抑制劑轉(zhuǎn)染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)增高,has-miR-146a-5p模擬物轉(zhuǎn)染MSCs后,h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)降低。報(bào)道顯示,miR-146是NF-kB通路的負(fù)反饋調(diào)節(jié)者,表達(dá)miR-146a的細(xì)胞,其IκBα的絲氨酸32位置的磷酸化將降低至～40%。因此,我們推斷,MSCs誘導(dǎo)過程中,has-miR-138-5p減少,導(dǎo)致其調(diào)節(jié)的靶基因h-NFKB1、h-RELA、h-RELB表達(dá)增加,從而激活NF-κB信號(hào)通路,這時(shí),作為一個(gè)負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制,has-miR-146a-5p表達(dá)增加,導(dǎo)致h-IRAK1、h-TRAF2和h-TRAF6表達(dá)降低,從而從上游調(diào)節(jié)和抑制NF-κB的活化。結(jié)論：在MSCs誘導(dǎo)分化成SGLCs過程中,has-miR-138-5p下調(diào)激活NF-κB通路,has-miR-146a-5p上調(diào),負(fù)反饋抑制NF-κB活化,兩者形成NF-κB正負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。MicroRNAs介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)是誘導(dǎo)MSCs分化成SGLCs的關(guān)鍵分子機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 汗腺細(xì)胞 誘導(dǎo)分化 microRNA NF-κB信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 英文縮略表7-9
• 中文摘要9-12
• 英文摘要12-15
• 前言15-18
• 一 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和人皮膚汗腺細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定18-34
• 1. 材料18-23
• 1.1 主要試劑18-19
• 1.2 主要儀器19-20
• 1.3 試劑配制20-23
• 1.4 標(biāo)本來源23
• 2. 方法23-28
• 2.1 人MSCs的傳代培養(yǎng)、分化功能鑒定23-26
• 2.2 人SGCs的分離、純化、培養(yǎng)和抗原表達(dá)26-28
• 3. 結(jié)果28-32
• 3.1 人MSCs的分離與培養(yǎng)28
• 3.2 人SGCs的分離、培養(yǎng)與純化28-31
• 3.3 人MSCs誘導(dǎo)分化功能31-32
• 3.4 人SGCs的抗原表達(dá)的鑒定32
• 4. 討論32-34
• 二 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞34-45
• 1. 材料34
• 1.1 主要試劑34
• 1.2 主要儀器34
• 1.3 試劑配制34
• 1.4 標(biāo)本來源34
• 2. 方法34-36
• 2.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞的培養(yǎng)模型構(gòu)建34-35
• 2.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人皮膚汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)前后細(xì)胞表型的鑒定35-36
• 3. 結(jié)果36-43
• 3.1 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞與人皮膚汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)的變化36-38
• 3.2 人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為汗腺樣細(xì)胞過程中細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變38-43
• 4. 討論43-45
• 三 MSCs誘導(dǎo)前后及汗腺組織的microRNA表達(dá)譜實(shí)驗(yàn)及結(jié)果分析45-60
• 1. 材料45-46
• 1.1 主要試劑45
• 1.2 主要儀器45-46
• 1.3 標(biāo)本來源46
• 2. 方法46-52
• 2.1 MicroRNA芯片檢測(cè)樣本制備46-47
• 2.2 Affymetrix microRNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)47-52
• 3. 結(jié)果52-57
• 3.1 MicroRNA聚類分析和散點(diǎn)圖52-54
• 3.2 MicroRNA數(shù)據(jù)比對(duì)分析54-57
• 4. 討論57-60
• 第四部分 MicroRNA作用靶點(diǎn)和參與NF-κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)的研究60-80
• 1. 材料60-61
• 1.1 主要試劑60
• 1.2 主要儀器60-61
• 2. 方法61-68
• 2.1 與汗腺發(fā)育相關(guān)的microRNAs及其靶點(diǎn)分析61-62
• 2.2 Has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p轉(zhuǎn)染MSCs62-63
• 2.3 Has-miR-138-5p和has-miR-146a-5p的靶點(diǎn)檢測(cè)63-67
• 2.4 細(xì)胞免疫化學(xué)染色67-68
• 3. 結(jié)果68-78
• 3.1 與汗腺發(fā)育相關(guān)的microRNAs及其靶點(diǎn)分析68-70
• 3.2 Hsa-miR-138-5p和hsa-miR-146a-5p轉(zhuǎn)染MSCs結(jié)果分析70-72
• 3.3 驗(yàn)證hsa-miR-138-5p和hsa-miR-146a-5p作用靶點(diǎn)72-76
• 3.4 Hsa-miR-138-5p誘導(dǎo)MSCs分化為SGLCs生物功能鑒定76-78
• 4. 討論78-80
• 總結(jié)80-82
• 參考文獻(xiàn)82-86
• 文獻(xiàn)綜述86-112
• 參考文獻(xiàn)102-112
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及參與科研情況112-113
• 致謝113

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 周崗,付小兵;汗腺中EGF、EGFR、IL和CKs等基因的表達(dá)特征及意義[J];創(chuàng)傷外科雜志;2005年05期

2 周崗;付小兵;陳偉;李海紅;姜篤銀;白曉東;雷永紅;孫同柱;;胎兒皮膚EGF、EGFR基因表達(dá)特征及與汗腺形成的關(guān)系研究[J];創(chuàng)傷外科雜志;2006年01期

3 譚志軍;陳艷;趙洪良;趙換軍;孫同柱;馬奎;張翠萍;付小兵;;胰酶-EDTA差速消化法純化原代培養(yǎng)的汗腺細(xì)胞[J];感染、炎癥、修復(fù);2013年04期

4 趙換軍;趙洪良;張翠萍;付小兵;;DNA甲基化對(duì)干細(xì)胞分化的影響及其作用方式[J];感染、炎癥、修復(fù);2013年04期

5 陳艷;趙洪良;譚志軍;趙煥軍;張翠萍;付小兵;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究[J];感染、炎癥、修復(fù);2014年02期

6 周崗;謝曉華;楊靖;付小兵;孫同柱;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向汗腺細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)中基因表達(dá)方式的研究[J];軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào);2011年10期

7 李海紅;付小兵;歐陽云淑;周崗;陳偉;孫同柱;;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化為汗腺細(xì)胞的體外研究[J];中華創(chuàng)傷雜志;2006年02期

8 歐陽云淑;賈赤宇;戚可名;付小兵;;與人汗腺細(xì)胞共培養(yǎng)的人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶通路的作用[J];中華燒傷雜志;2006年05期

9 周崗;謝曉華;付小兵;楊靖;孫同柱;;汗腺細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)過程中基因表達(dá)變化及意義[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2007年10期

10 周崗;李海紅;付小兵;;外胚葉發(fā)育不全基因信號(hào)途徑與汗腺發(fā)育及修復(fù)的關(guān)系[J];中國(guó)修復(fù)重建外科雜志;2006年05期

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本文編號(hào)：990936