本文關(guān)鍵詞：擬南芥STM、WUS和CLV3相互作用調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞活性的研究

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【摘要】：莖端分生組織是植物莖、葉和花等地上部分器官發(fā)生的來源。莖端分生組織的組織中心和其上方的干細(xì)胞構(gòu)成的干細(xì)胞微環(huán)境是維持分生組織的基礎(chǔ)。WUSCHEL(WUS)編碼組織中心的關(guān)鍵調(diào)控因子,能夠誘導(dǎo)干細(xì)胞特征基因CLAVATA3 (CLV3)在組織中心上方的細(xì)胞中表達(dá),并賦予它們干細(xì)胞的特征。盡管目前對WUS的功能有了一定的認(rèn)識,但是對于WUS如何調(diào)節(jié)干細(xì)胞命運的機制尚需進(jìn)一步深入研究。本研究中我們篩選到多個擬南芥WUS互作蛋白,其中包括莖端分生組織特異調(diào)控因子SHOOT MERISTEMLESS (STM)。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),WUS和STM發(fā)生直接的相互作用,并能共同結(jié)合CLV3基因的啟動子以激活其表達(dá),從而調(diào)控莖端分生組織干細(xì)胞的活性。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：(1)STM蛋白與WUS蛋白之間存在直接的相互作用為了進(jìn)一步揭示W(wǎng)US蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育過程中的分子機理,我們利用免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質(zhì)譜技術(shù),尋找WUS蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育過程中的互作因子。實驗結(jié)果顯示,SHOOT MERISTEMLESS (STM)蛋白與WUS蛋白在擬南芥體內(nèi)存在直接的相互作用。STM基因?qū)ηo端分生組織的建成與維持都具有非常重要的作用。我們利用Pull-Down、酵母雙雜交等實驗進(jìn)一步證實兩者之間存在直接的相互作用。(2)STM基因與WUS基因表達(dá)模式的分析利用激光共聚焦顯微鏡對pSTM::STM-VENUS與pWUS::WUS-3GFP轉(zhuǎn)基因植株中STM因與WUS基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)最早在16細(xì)胞胚時期檢測到了WUS蛋白的信號,而此時并未檢測到STM蛋白的出現(xiàn)；而在三角形胚時期,心形胚時期,WUS蛋白與STM蛋白的信號都是共定位的；在幼苗期及生殖發(fā)育階段,整個莖端分生組織充滿了STM蛋白的信號,而WUS蛋白的信號集中在組織中心區(qū)域,包含在STM蛋白的表達(dá)范圍之內(nèi)。(3)STM蛋白直接調(diào)控CLV3基因的表達(dá)我們檢測了stm突變體與STM基因過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株中CLV3基因的表達(dá)量,RT-PCR結(jié)果顯示,與野生型相比,在stm突變體中CLV3基因的表達(dá)量明顯下降,而利用地塞米松誘導(dǎo)的35S::STM-GR的轉(zhuǎn)基因植株中,CLV3的表達(dá)量顯著升高。經(jīng)過分析啟動子結(jié)構(gòu),我們發(fā)現(xiàn)CLV3基因啟動子區(qū)域存在STM蛋白特異結(jié)合的核心序列,STM蛋白能否直接調(diào)控CLV3基因的表達(dá)呢?染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗表明,在擬南芥植株體內(nèi)STM蛋白與CLV3基因之間存在著相互作用。經(jīng)過凝膠遷移率實驗(EMSA)進(jìn)一步驗證,STM蛋白可以直接結(jié)合在CLV3基因的啟動子上激活其表達(dá)。(4)STM與WUS蛋白相互作用共同調(diào)控CLV3基因的表達(dá)利用CLV3啟動子啟動CLV3基因全長互補clv3-2突變體,恢復(fù)了野生型表型；而分別突變CLV3基因啟動子上WUS蛋白或STM蛋白的結(jié)合位點之后啟動CLV3基因全長互補clv3-2突變體,均只能部分恢復(fù)突變體表型；當(dāng)同時突變CLV3基因啟動子上WUS與STM蛋白的結(jié)合位點之后互補clv3-2突變體,突變體的表型則完全不能恢復(fù)。另外,將擬南芥植株中STM的表達(dá)量下調(diào)之后,WUS蛋白對CLV3基因的結(jié)合能力明顯下降；同時,若將植株中WUS的表達(dá)量下調(diào)之后,STM蛋白對CLV3的結(jié)合能力也呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。(5)CLV3與STM之間存在反饋調(diào)節(jié)機制本實驗中利用qRT-PCR對clv3突變體中STM基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測,發(fā)現(xiàn)在clv3突變體中STM基因的表達(dá)量與野生型相比有了顯著提高。原位雜交結(jié)果顯示,clv3突變體中STM基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物也有明顯的增加。以上實驗結(jié)果說明,在莖端分生組織的發(fā)育過程中,CLV3基因會抑制STM基因的表達(dá),從而在兩者之間形成了一個類似于CLV3-WUS之間的反饋調(diào)節(jié)環(huán)。綜上所述,STM蛋白在調(diào)控莖端分生組織發(fā)育的過程中與WUS蛋白存在直接的相互作用,同時STM蛋白還能夠直接結(jié)合到CLV3基因的啟動子上激活CLV3基因的表達(dá)。因此,STM與WUS蛋白可以相互作用共同調(diào)控CLV3基因的表達(dá),當(dāng)CLV3蛋白積累到一定量之后會反過來抑制STM基因與WUS基因的表達(dá),從而維持莖端分生組織中干細(xì)胞的數(shù)量。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析擬南芥莖端分生組織干細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控機制提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：擬南芥 莖端分生組織 WUS 干細(xì)胞 蛋白互作 STM 轉(zhuǎn)錄調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-46
• 1.1 植物分生組織14-19
• 1.1.1 植物分生組織的發(fā)育14-18
• 1.1.1.1 植物莖端分生組織的發(fā)育17
• 1.1.1.2 植物根端分生組織的發(fā)育17-18
• 1.1.2 植物分生組織與植物生長發(fā)育18-19
• 1.2 莖端分生組織的結(jié)構(gòu)19-24
• 1.2.1 莖端分生組織的細(xì)胞學(xué)分區(qū)20-21
• 1.2.2 莖端分生組織的胚性起始21-22
• 1.2.3 莖端分生組織活性的維持22-24
• 1.3 莖端分生組織干細(xì)胞24-32
• 1.3.1 莖端分生組織干細(xì)胞的細(xì)胞學(xué)特征25-26
• 1.3.2 莖端分生組織干細(xì)胞的起始與終止26-30
• 1.3.3 莖端分生組織干細(xì)胞在側(cè)生器官分化中的作用30-32
• 1.4 莖端分生組織干細(xì)胞的分子遺傳調(diào)控32-43
• 1.4.1 WUS基因調(diào)控莖端干細(xì)胞的活性36-37
• 1.4.2 CLV基因調(diào)控莖端干細(xì)胞的活性37-39
• 1.4.3 調(diào)控莖端干細(xì)胞形成和維持的CLV-WUS反饋調(diào)節(jié)機制39-40
• 1.4.4 WUS與STM基因在調(diào)控莖端干細(xì)胞發(fā)育中共同起作用40-43
• 1.5 植物干細(xì)胞與動物干細(xì)胞的區(qū)別43-44
• 1.6 本研究的目的及意義44-46
• 2 材料與方法46-69
• 2.1 材料46-47
• 2.1.1 植物材料及生長條件46
• 2.1.2 菌株和質(zhì)粒46
• 2.1.3 酶、生化試劑及儀器46-47
• 2.1.4 常用緩沖液及培養(yǎng)基的配制47
• 2.2 實驗方法47-69
• 2.2.1 擬南芥的種植方法47-48
• 2.2.2 植物基因組的提取及純化48-49
• 2.2.3 PCR擴增實驗49
• 2.2.4 植物總RNA的提取49-50
• 2.2.5 反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成50-51
• 2.2.6 實時定量PCR分析51-52
• 2.2.7 根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)細(xì)胞的制備與細(xì)胞轉(zhuǎn)化52-53
• 2.2.7.1 農(nóng)桿菌菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備52
• 2.7.7.2 電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌細(xì)胞52-53
• 2.2.8 擬南芥的轉(zhuǎn)化53
• 2.2.9 表達(dá)載體的構(gòu)建53-54
• 2.2.10 蛋白表達(dá)純化54-56
• 2.2.10.1 His-STM蛋白的表達(dá)純化54-56
• 2.2.10.2 GST-WUS蛋白的表達(dá)純化56
• 2.2.11 酵母單雜交實驗56-58
• 2.2.11.1 試劑配制56-57
• 2.2.11.2 酵母單雜交表達(dá)載體構(gòu)建57
• 2.2.11.3 酵母轉(zhuǎn)化57-58
• 2.2.12 酵母雙雜交實驗58
• 2.2.13 Pull-Down實驗58
• 2.2.14 凝膠遷移率實驗EMSA58-60
• 2.2.14.1 生物素標(biāo)記EMSA探針的制備59
• 2.2.14.2 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備59
• 2.2.14.3 DNA探針與蛋白質(zhì)結(jié)合59
• 2.2.14.4 電泳和轉(zhuǎn)膜59-60
• 2.2.15 染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)60-63
• 2.2.15.1 染色質(zhì)交聯(lián)60-62
• 2.2.15.2 ChIP實驗過程中所用試劑配方62
• 2.2.15.3 染色質(zhì)免疫共沉淀中所用引物62-63
• 2.2.16 免疫共沉淀(Co-IP)63-64
• 2.2.16.1 免疫共沉淀步驟63
• 2.2.16.2 免疫共沉淀實驗中所用試劑配方63-64
• 2.2.17 共聚焦顯微鏡觀察和圖像處理64
• 2.2.18 基因槍轟擊擬南芥莖端實驗64-66
• 2.2.18.1 基因槍微彈的準(zhǔn)備步驟65
• 2.2.18.2 基因槍轉(zhuǎn)化65-66
• 2.2.19 原位雜交分析66-69
• 2.2.19.1 材料的固定66
• 2.2.19.2 材料的包埋66
• 2.2.19.3 切片66-67
• 2.2.19.4 脫蠟、消化、乙�；碗s交67-68
• 2.2.19.5 洗片68
• 2.2.19.6 檢測68-69
• 3 結(jié)果與分析69-85
• 3.1 免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析尋找WUS蛋白的互作因子69-71
• 3.1.1 pWUS::WUS-3GFP轉(zhuǎn)基因植株的鑒定69-70
• 3.1.2 免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜實驗過程70-71
• 3.2 WUS蛋白與STM蛋白存在直接的相互作用71-73
• 3.2.1 酵母雙雜交實驗證實STM蛋白與WUS蛋白之間存在相互作用71-72
• 3.2.2 Pull-Down實驗證實STM蛋白與WUS蛋白存在相互作用72
• 3.2.3 免疫共沉淀結(jié)果證實STM蛋白與WUS蛋白在擬南芥體內(nèi)存在直接相互作用72-73
• 3.3 STM基因與WUS基因在擬南芥不同發(fā)育時期的表達(dá)模式73-75
• 3.4 STM蛋白對CLV3基因的表達(dá)調(diào)控75-76
• 3.5 STM蛋白直接調(diào)控CLV3基因的轉(zhuǎn)錄76-80
• 3.5.1 ChIP實驗證實在擬南芥體內(nèi)存在STM蛋白對CLV3基因的調(diào)控作用76-78
• 3.5.2 EMSA實驗顯示STM蛋白可以直接結(jié)合到CLV3基因的啟動子上78
• 3.5.3 酵母單雜交實驗證實STM蛋白與CLV3基因之間存在直接的相互作用78-79
• 3.5.4 瞬時轉(zhuǎn)化實驗顯示STM蛋白直接激活CLV3基因的表達(dá)79-80
• 3.6 STM蛋白與WUS蛋白共同參與了對CLV3基因的表達(dá)調(diào)控80-83
• 3.6.1 STM蛋白與WUS蛋白可以同時結(jié)合到CLV3基因的啟動子上80-81
• 3.6.2 STM蛋白與WUS蛋白共同激活CLV3基因的表達(dá)81
• 3.6.3 CLV3基因的正常表達(dá)受到STM與WUS蛋白共同調(diào)控81-83
• 3.7 CLV3與STM基因之間存在反饋調(diào)節(jié)機制83-85
• 4 討論85-89
• 5 結(jié)論89-90
• 參考文獻(xiàn)90-103
• 致謝103-104
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況104

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本文編號：990718