本文關鍵詞：擬南芥STM、WUS和CLV3相互作用調控莖端分生組織干細胞活性的研究

  更多相關文章： 擬南芥 莖端分生組織 WUS 干細胞 蛋白互作 STM 轉錄調控

【摘要】：莖端分生組織是植物莖、葉和花等地上部分器官發(fā)生的來源。莖端分生組織的組織中心和其上方的干細胞構成的干細胞微環(huán)境是維持分生組織的基礎。WUSCHEL(WUS)編碼組織中心的關鍵調控因子,能夠誘導干細胞特征基因CLAVATA3 (CLV3)在組織中心上方的細胞中表達,并賦予它們干細胞的特征。盡管目前對WUS的功能有了一定的認識,但是對于WUS如何調節(jié)干細胞命運的機制尚需進一步深入研究。本研究中我們篩選到多個擬南芥WUS互作蛋白,其中包括莖端分生組織特異調控因子SHOOT MERISTEMLESS (STM)。我們的研究結果發(fā)現(xiàn),WUS和STM發(fā)生直接的相互作用,并能共同結合CLV3基因的啟動子以激活其表達,從而調控莖端分生組織干細胞的活性。主要研究結果和結論如下：(1)STM蛋白與WUS蛋白之間存在直接的相互作用為了進一步揭示W(wǎng)US蛋白在調控莖端分生組織發(fā)育過程中的分子機理,我們利用免疫共沉淀聯(lián)合蛋白質譜技術,尋找WUS蛋白在調控莖端分生組織發(fā)育過程中的互作因子。實驗結果顯示,SHOOT MERISTEMLESS (STM)蛋白與WUS蛋白在擬南芥體內存在直接的相互作用。STM基因對莖端分生組織的建成與維持都具有非常重要的作用。我們利用Pull-Down、酵母雙雜交等實驗進一步證實兩者之間存在直接的相互作用。(2)STM基因與WUS基因表達模式的分析利用激光共聚焦顯微鏡對pSTM::STM-VENUS與pWUS::WUS-3GFP轉基因植株中STM因與WUS基因的表達模式進行了分析,發(fā)現(xiàn)最早在16細胞胚時期檢測到了WUS蛋白的信號,而此時并未檢測到STM蛋白的出現(xiàn)；而在三角形胚時期,心形胚時期,WUS蛋白與STM蛋白的信號都是共定位的；在幼苗期及生殖發(fā)育階段,整個莖端分生組織充滿了STM蛋白的信號,而WUS蛋白的信號集中在組織中心區(qū)域,包含在STM蛋白的表達范圍之內。(3)STM蛋白直接調控CLV3基因的表達我們檢測了stm突變體與STM基因過表達的轉基因植株中CLV3基因的表達量,RT-PCR結果顯示,與野生型相比,在stm突變體中CLV3基因的表達量明顯下降,而利用地塞米松誘導的35S::STM-GR的轉基因植株中,CLV3的表達量顯著升高。經(jīng)過分析啟動子結構,我們發(fā)現(xiàn)CLV3基因啟動子區(qū)域存在STM蛋白特異結合的核心序列,STM蛋白能否直接調控CLV3基因的表達呢?染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗表明,在擬南芥植株體內STM蛋白與CLV3基因之間存在著相互作用。經(jīng)過凝膠遷移率實驗(EMSA)進一步驗證,STM蛋白可以直接結合在CLV3基因的啟動子上激活其表達。(4)STM與WUS蛋白相互作用共同調控CLV3基因的表達利用CLV3啟動子啟動CLV3基因全長互補clv3-2突變體,恢復了野生型表型；而分別突變CLV3基因啟動子上WUS蛋白或STM蛋白的結合位點之后啟動CLV3基因全長互補clv3-2突變體,均只能部分恢復突變體表型；當同時突變CLV3基因啟動子上WUS與STM蛋白的結合位點之后互補clv3-2突變體,突變體的表型則完全不能恢復。另外,將擬南芥植株中STM的表達量下調之后,WUS蛋白對CLV3基因的結合能力明顯下降；同時,若將植株中WUS的表達量下調之后,STM蛋白對CLV3的結合能力也呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。(5)CLV3與STM之間存在反饋調節(jié)機制本實驗中利用qRT-PCR對clv3突變體中STM基因的表達量進行了檢測,發(fā)現(xiàn)在clv3突變體中STM基因的表達量與野生型相比有了顯著提高。原位雜交結果顯示,clv3突變體中STM基因的轉錄產(chǎn)物也有明顯的增加。以上實驗結果說明,在莖端分生組織的發(fā)育過程中,CLV3基因會抑制STM基因的表達,從而在兩者之間形成了一個類似于CLV3-WUS之間的反饋調節(jié)環(huán)。綜上所述,STM蛋白在調控莖端分生組織發(fā)育的過程中與WUS蛋白存在直接的相互作用,同時STM蛋白還能夠直接結合到CLV3基因的啟動子上激活CLV3基因的表達。因此,STM與WUS蛋白可以相互作用共同調控CLV3基因的表達,當CLV3蛋白積累到一定量之后會反過來抑制STM基因與WUS基因的表達,從而維持莖端分生組織中干細胞的數(shù)量。研究結果為進一步分析擬南芥莖端分生組織干細胞發(fā)育的調控機制提供了新的思路。
【關鍵詞】：擬南芥 莖端分生組織 WUS 干細胞 蛋白互作 STM 轉錄調控
【學位授予單位】：山東農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-14
• 1 前言14-46
• 1.1 植物分生組織14-19
• 1.1.1 植物分生組織的發(fā)育14-18
• 1.1.1.1 植物莖端分生組織的發(fā)育17
• 1.1.1.2 植物根端分生組織的發(fā)育17-18
• 1.1.2 植物分生組織與植物生長發(fā)育18-19
• 1.2 莖端分生組織的結構19-24
• 1.2.1 莖端分生組織的細胞學分區(qū)20-21
• 1.2.2 莖端分生組織的胚性起始21-22
• 1.2.3 莖端分生組織活性的維持22-24
• 1.3 莖端分生組織干細胞24-32
• 1.3.1 莖端分生組織干細胞的細胞學特征25-26
• 1.3.2 莖端分生組織干細胞的起始與終止26-30
• 1.3.3 莖端分生組織干細胞在側生器官分化中的作用30-32
• 1.4 莖端分生組織干細胞的分子遺傳調控32-43
• 1.4.1 WUS基因調控莖端干細胞的活性36-37
• 1.4.2 CLV基因調控莖端干細胞的活性37-39
• 1.4.3 調控莖端干細胞形成和維持的CLV-WUS反饋調節(jié)機制39-40
• 1.4.4 WUS與STM基因在調控莖端干細胞發(fā)育中共同起作用40-43
• 1.5 植物干細胞與動物干細胞的區(qū)別43-44
• 1.6 本研究的目的及意義44-46
• 2 材料與方法46-69
• 2.1 材料46-47
• 2.1.1 植物材料及生長條件46
• 2.1.2 菌株和質粒46
• 2.1.3 酶、生化試劑及儀器46-47
• 2.1.4 常用緩沖液及培養(yǎng)基的配制47
• 2.2 實驗方法47-69
• 2.2.1 擬南芥的種植方法47-48
• 2.2.2 植物基因組的提取及純化48-49
• 2.2.3 PCR擴增實驗49
• 2.2.4 植物總RNA的提取49-50
• 2.2.5 反轉錄cDNA第一鏈的合成50-51
• 2.2.6 實時定量PCR分析51-52
• 2.2.7 根癌農(nóng)桿菌菌株GV3101感受態(tài)細胞的制備與細胞轉化52-53
• 2.2.7.1 農(nóng)桿菌菌株感受態(tài)細胞的制備52
• 2.7.7.2 電轉化法轉化農(nóng)桿菌細胞52-53
• 2.2.8 擬南芥的轉化53
• 2.2.9 表達載體的構建53-54
• 2.2.10 蛋白表達純化54-56
• 2.2.10.1 His-STM蛋白的表達純化54-56
• 2.2.10.2 GST-WUS蛋白的表達純化56
• 2.2.11 酵母單雜交實驗56-58
• 2.2.11.1 試劑配制56-57
• 2.2.11.2 酵母單雜交表達載體構建57
• 2.2.11.3 酵母轉化57-58
• 2.2.12 酵母雙雜交實驗58
• 2.2.13 Pull-Down實驗58
• 2.2.14 凝膠遷移率實驗EMSA58-60
• 2.2.14.1 生物素標記EMSA探針的制備59
• 2.2.14.2 6%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備59
• 2.2.14.3 DNA探針與蛋白質結合59
• 2.2.14.4 電泳和轉膜59-60
• 2.2.15 染色質免疫共沉淀(ChIP)60-63
• 2.2.15.1 染色質交聯(lián)60-62
• 2.2.15.2 ChIP實驗過程中所用試劑配方62
• 2.2.15.3 染色質免疫共沉淀中所用引物62-63
• 2.2.16 免疫共沉淀(Co-IP)63-64
• 2.2.16.1 免疫共沉淀步驟63
• 2.2.16.2 免疫共沉淀實驗中所用試劑配方63-64
• 2.2.17 共聚焦顯微鏡觀察和圖像處理64
• 2.2.18 基因槍轟擊擬南芥莖端實驗64-66
• 2.2.18.1 基因槍微彈的準備步驟65
• 2.2.18.2 基因槍轉化65-66
• 2.2.19 原位雜交分析66-69
• 2.2.19.1 材料的固定66
• 2.2.19.2 材料的包埋66
• 2.2.19.3 切片66-67
• 2.2.19.4 脫蠟、消化、乙�；碗s交67-68
• 2.2.19.5 洗片68
• 2.2.19.6 檢測68-69
• 3 結果與分析69-85
• 3.1 免疫共沉淀結合質譜分析尋找WUS蛋白的互作因子69-71
• 3.1.1 pWUS::WUS-3GFP轉基因植株的鑒定69-70
• 3.1.2 免疫共沉淀結合質譜實驗過程70-71
• 3.2 WUS蛋白與STM蛋白存在直接的相互作用71-73
• 3.2.1 酵母雙雜交實驗證實STM蛋白與WUS蛋白之間存在相互作用71-72
• 3.2.2 Pull-Down實驗證實STM蛋白與WUS蛋白存在相互作用72
• 3.2.3 免疫共沉淀結果證實STM蛋白與WUS蛋白在擬南芥體內存在直接相互作用72-73
• 3.3 STM基因與WUS基因在擬南芥不同發(fā)育時期的表達模式73-75
• 3.4 STM蛋白對CLV3基因的表達調控75-76
• 3.5 STM蛋白直接調控CLV3基因的轉錄76-80
• 3.5.1 ChIP實驗證實在擬南芥體內存在STM蛋白對CLV3基因的調控作用76-78
• 3.5.2 EMSA實驗顯示STM蛋白可以直接結合到CLV3基因的啟動子上78
• 3.5.3 酵母單雜交實驗證實STM蛋白與CLV3基因之間存在直接的相互作用78-79
• 3.5.4 瞬時轉化實驗顯示STM蛋白直接激活CLV3基因的表達79-80
• 3.6 STM蛋白與WUS蛋白共同參與了對CLV3基因的表達調控80-83
• 3.6.1 STM蛋白與WUS蛋白可以同時結合到CLV3基因的啟動子上80-81
• 3.6.2 STM蛋白與WUS蛋白共同激活CLV3基因的表達81
• 3.6.3 CLV3基因的正常表達受到STM與WUS蛋白共同調控81-83
• 3.7 CLV3與STM基因之間存在反饋調節(jié)機制83-85
• 4 討論85-89
• 5 結論89-90
• 參考文獻90-103
• 致謝103-104
• 攻讀學位期間發(fā)表論文情況104

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李正理;胡玉熹;劉淑瓊;;薄荷離體莖的形態(tài)分化研究 Ⅰ.秋水仙堿對于離體培養(yǎng)下莖端的影響[J];Journal of Integrative Plant Biology;1964年01期

2 李正理;孫安慈;桂耀林;;離體培養(yǎng)草石蠶莖端的實驗形態(tài)研究 Ⅱ.幾種刺激生長物質對于離體莖端形態(tài)分化的影響[J];Journal of Integrative Plant Biology;1964年03期

3 朱玉賢;;植物莖端分生組織調節(jié)機制研究新進展[J];科學通報;2008年15期

4 沈銀柱;孟慶昌;吳保東;王穎;常仲邏;;普通小麥質片及莖端離體培養(yǎng)的研究[J];河北師范大學學報;1989年03期

5 譚文勃;李玉花;徐啟江;;植物莖端分生組織中的莖干細胞調控機制[J];植物生理學通訊;2008年04期

6 李正理;桂耀林;;薄荷離體莖的形態(tài)分化研究 Ⅱ.MH對于離體培養(yǎng)下莖端的影響[J];Journal of Integrative Plant Biology;1973年02期

7 白書農(nóng),譚克輝;對光敏水稻研究的回顧與反思:植物光周期現(xiàn)象中葉片信息對莖端的形態(tài)建成事件有專一性嗎?[J];科學通報;2001年09期

8 李正理;孫安慈;;草石蠶(Stachys sieboldii)離體莖端的塊莖形成[J];Journal of Integrative Plant Biology;1965年02期

9 金仕萍;金淑梅;曹國儀;任錫疇;;牽牛開花誘導和幾種磷酸酯酶的消長變化[J];Journal of Integrative Plant Biology;1986年05期

10 劉寧;;被子植物的莖端分生組織及其細胞的命運[J];生物學通報;2008年07期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 畢冬玲;汪矛;;桔梗莖頂端的發(fā)育動態(tài)[A];第十屆全國植物結構與生殖生物學學術研討會會議報告摘要[C];2012年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周超;擬南芥STM、WUS和CLV3相互作用調控莖端分生組織干細胞活性的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 滕飛;擬南芥AP2/ERF基因ERF055調控莖端分生組織發(fā)育的功能研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學;2013年

，

本文編號：990718