本文關(guān)鍵詞：脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的機(jī)制研究

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【摘要】：目的：通過(guò)研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能活性,進(jìn)一步明確脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管生成的生物學(xué)效應(yīng),進(jìn)而驗(yàn)證和了解脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用的分子機(jī)制，探討AD-MSCs促進(jìn)HUVECs發(fā)揮功能活性的途徑,為進(jìn)一步研究脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及無(wú)細(xì)胞治療體系在臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：第一部分細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定①分離培養(yǎng)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞脂肪組織來(lái)自健康女性吸脂者,經(jīng)組織標(biāo)本所屬人知情。②用誘導(dǎo)液對(duì)分離培養(yǎng)的脂肪來(lái)源干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。誘導(dǎo)其向脂肪細(xì)胞及骨細(xì)胞方向分化,分別用油紅0和茜素紅-S檢測(cè)其向成脂和成骨分化。③通過(guò)流式細(xì)胞儀明確人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞CD31陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。第二部分選取第3-6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,由原來(lái)含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM高糖培養(yǎng)液,過(guò)夜收集其上清液,離心后加入3%和5%的FBS備用。用含相應(yīng)濃度FBS的DMEM設(shè)立正常對(duì)照組,分別進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)、Matrigel成管實(shí)驗(yàn)、Matrigel三維培養(yǎng)的出茅實(shí)驗(yàn)。計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)表示用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)差表示,第三部分分子機(jī)制研究①用雙抗體夾心ELISA去檢測(cè)收集上清液VEGF濃度；②在Transwell體系間接共培養(yǎng),觀察HUVEC在AD-MSCs的誘導(dǎo)下遷移。③用雙抗體夾心ELISA法測(cè)定Transwell培養(yǎng)體系中VEGF濃度水平；④分析培養(yǎng)體系中AD-MSCs與HUVECs分泌VEGF勺差異性。⑤提取相應(yīng)HUVECs的總蛋白和總RNA。進(jìn)行、Vestern blot檢測(cè)，測(cè)定HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3蛋白的表達(dá)；⑥以提取的RNA為模板,轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)一步進(jìn)行Real-time PCR,檢測(cè)HIF-1α、VEGF及Cdk5Rap3的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：第一部分.①人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)和AD-MSCs在10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)液流式鑒定培養(yǎng)下生長(zhǎng)良好。②培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞免疫組織化學(xué)CD31陽(yáng)性,定位于細(xì)胞膜。③FCM結(jié)果顯示,CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占檢測(cè)總數(shù)的98.3%,CD34陽(yáng)性細(xì)胞僅占檢測(cè)總數(shù)的0.016%。④脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞能定向誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞即骨細(xì)胞，油紅O和茜素紅S檢測(cè)陽(yáng)性。第二部分①CCK-8細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 用MSC-CM處理的HUVECs 24小時(shí)與對(duì)照組P值0.01,兩者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。培養(yǎng)36小時(shí)后,P值0.05,兩者有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②劃痕實(shí)驗(yàn)MSC-CM組在前六小時(shí)的遷移速率就高于Control組。至12小時(shí)，，MSC-CM組細(xì)胞侵入面積已達(dá)42%,而對(duì)照組僅為10%左右。③管腔形成實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組節(jié)點(diǎn)數(shù)平均為21個(gè)/視野,而對(duì)照組為12個(gè)/視野,成組T檢驗(yàn)得知P0.001,具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④出芽實(shí)驗(yàn)亦顯示,實(shí)驗(yàn)組與Control組P=0.004,兩者具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第三部分①脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞上清的VEGF濃度與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上清中VEGF的濃度兩者具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。遷移實(shí)驗(yàn)②Transwells誘導(dǎo)組與對(duì)AD-MSC照組兩者具有極其顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。③來(lái)自組的上清液中AD-MSCs濃度為26.87±2.7VEGF而7pg/mL,組則僅為7.65±1.2Vehicle(表3-6),兩者有極其顯3pg/mL著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001)。④每1×104個(gè)細(xì)胞為單位,與HUCVEC-CM之間MS C-CM比較分泌的量有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)：⑤經(jīng)MSC-CM處理的VRGF其表達(dá)HUVECs,蛋白的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào),⑥VEGF、HIF-1α及Cdk5Rap3結(jié)果相與Western Blot似，各自的表達(dá)均有增加。nRNA結(jié)論：可以促進(jìn)AD-MSCs的生物學(xué)增殖、遷移、管腔結(jié)構(gòu)形成效應(yīng),其外HUVECs在通過(guò)分泌等促進(jìn)VEGF的功能活性,內(nèi)在通過(guò)調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白分子VEGF、H1F-1αHUVECs及3表達(dá)。CDK5RAP
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 血管化 內(nèi)皮細(xì)胞 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 逆轉(zhuǎn)錄
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 縮略詞表5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-16
• 第一部分 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定16-29
• 材料16-18
• 方法18-22
• 結(jié)果22-26
• 討論26-29
• 第二部分 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成效應(yīng)29-43
• 材料29-31
• 方法31-35
• 結(jié)果35-39
• 討論39-43
• 第三部分 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能活性的分子機(jī)制43-67
• 材料43-46
• 方法46-54
• 結(jié)果54-63
• 討論63-67
• 小結(jié)67-69
• 參考文獻(xiàn)69-77
• 文獻(xiàn)綜述77-86
• 參考文獻(xiàn)81-86
• 附錄一86-97
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果97-99
• 致謝#@@

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本文編號(hào)：982716