發(fā)布時間：2017-09-28 03:14

  本文關(guān)鍵詞：枯草芽孢桿菌核糖體大亞基組裝過程的研究

  更多相關(guān)文章： 核糖體 組裝因子 YlqF 核糖體組裝中間體 冷凍電鏡

【摘要】：核糖體是細(xì)胞體內(nèi)負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的細(xì)胞器,由大亞基和小亞基組成。每個亞基都是由一到兩條長鏈rRNA和一系列核糖體蛋白質(zhì)組成的核糖核蛋白復(fù)合物。核糖體的組裝是細(xì)胞體內(nèi)所有代謝活動的基礎(chǔ),其組裝的效率和準(zhǔn)確性受到嚴(yán)格的細(xì)胞調(diào)控。核糖體組裝由很多不同的組裝事件組成,包括rRNA的折疊和核糖體蛋白質(zhì)結(jié)合。在體內(nèi),這個過程有很多組裝因子的參與。這些組裝因子的敲除或缺失會嚴(yán)重影響核糖體的成熟過程,導(dǎo)致細(xì)胞體內(nèi)組裝中間體的積累。組裝因子YlqF是一種GTPase,參與枯草芽孢桿菌大亞基的組裝過程。YlqF的缺失會導(dǎo)致50S大亞基前體45S的積累。本文中,我們利用定量質(zhì)譜和冷凍電鏡三維重構(gòu)的方法對45S組裝中間體的蛋白質(zhì)組成和23S rRNA的構(gòu)象狀態(tài)進(jìn)行分析。通過定量質(zhì)譜分析,我們發(fā)現(xiàn)45S中核糖體蛋白L28、L16、L33、L36和L35有非常嚴(yán)重的缺失。這種蛋白質(zhì)缺失模式與其他一些由于基因缺陷導(dǎo)致的50S大亞基前體的蛋白質(zhì)缺失模式非常類似,說明在50S亞基組裝后期有一個非常保守的限速步驟。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)45S核糖體包含有兩種構(gòu)象狀態(tài)的組裝中間體,State I和State II。這兩種構(gòu)象狀態(tài)蛋白質(zhì)缺失情況比較類似,且與定量質(zhì)譜結(jié)果一致。兩種構(gòu)象狀態(tài)的一些重要的功能區(qū)域都沒有正確組裝,如肽基轉(zhuǎn)移酶活性中心以及與小亞基的接觸面,因此都無法與tRNA以及小亞基結(jié)合。兩者的差別主要在CP和H38的成熟情況。State II中,CP高度不穩(wěn)定,H38位置發(fā)生了很大的偏轉(zhuǎn),與L7/L12 stalk形成了非自然狀態(tài)的相互作用;State I中,CP與H38已經(jīng)相互穩(wěn)定下來,H38的構(gòu)象類似于成熟狀態(tài)。通過對以上數(shù)據(jù)分析,我們構(gòu)建了50S大亞基體內(nèi)組裝后期的一條組裝通路:這條通路主要由兩部分組成,State II到State I的轉(zhuǎn)變以及State I到成熟50S的轉(zhuǎn)變。State II到State I主要是23S rRNA構(gòu)象的成熟,H38的重定向是一個關(guān)鍵的限速步驟;而State I到成熟50S的轉(zhuǎn)變主要是缺失的核糖體蛋白質(zhì)的結(jié)合。本文中我們還對YlqF與大亞基的相互作用進(jìn)行了研究。分別用體內(nèi)和體外裝配的方式獲得YlqF與成熟50S或45S的復(fù)合物,進(jìn)行冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析。結(jié)構(gòu)信息表明,YlqF的作用位點(diǎn)都位于23S rRNA上,尤其是H38/CP區(qū)域。因此YlqF很可能是作為一個rRNA分子伴侶,促進(jìn)H38和CP的正確折疊。
【關(guān)鍵詞】：核糖體 組裝因子 YlqF 核糖體組裝中間體 冷凍電鏡
【學(xué)位授予單位】：清華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q933
【目錄】：

• 摘要3-4
• Abstract4-10
• 第1章 引言10-40
• 1.1 核糖體的結(jié)構(gòu)與功能10-17
• 1.1.1 核糖體的結(jié)構(gòu)10-14
• 1.1.2 核糖體的功能：蛋白質(zhì)的翻譯過程14-17
• 1.2 核糖體組裝過程的研究17-29
• 1.2.1 核糖體體外組裝過程的研究18-20
• 1.2.2 核糖體體內(nèi)組裝過程的研究20-22
• 1.2.3 核糖體體內(nèi)組裝與體外組裝的比較22-23
• 1.2.4 組裝因子在核糖體體內(nèi)組裝過程中的作用23-29
• 1.3 冷凍電鏡技術(shù)及其在核糖體組裝過程研究中的應(yīng)用29-34
• 1.3.1 電子顯微鏡成像29-30
• 1.3.2 冷凍電鏡技術(shù)的主要方法30-31
• 1.3.3 冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展31-32
• 1.3.4 冷凍電鏡技術(shù)在核糖體組裝過程研究中的應(yīng)用32-34
• 1.4 枯草芽孢桿菌 50S亞基組裝因子YlqF研究進(jìn)展34-36
• 1.5 本課題研究內(nèi)容及研究意義36-40
• 1.5.1 本課題的主要研究內(nèi)容36-37
• 1.5.2 本課題研究的理論意義37
• 1.5.3 本課題研究的應(yīng)用價值37-40
• 第2章 枯草芽孢桿菌 50S大亞基組裝中間體的研究40-91
• 2.1 引言40
• 2.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器40-41
• 2.3 實(shí)驗(yàn)材料與方法-成熟 50S亞基部分41-53
• 2.3.1 枯草芽孢桿菌成熟 50S亞基的純化41-43
• 2.3.2 冷凍電鏡樣品制備43-45
• 2.3.3 冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集45-48
• 2.3.4 冷凍電鏡數(shù)據(jù)處理48-52
• 2.3.5 搭建原子模型52-53
• 2.4 實(shí)驗(yàn)材料與方法- 45S組裝中間體部分53-60
• 2.4.1 45S組裝中間體的純化53-55
• 2.4.2 45S組裝中間體的鑒定55
• 2.4.3 定量質(zhì)譜對 45S組裝中間體蛋白質(zhì)組成進(jìn)行定量分析55-57
• 2.4.4 45S組裝中間體電鏡數(shù)據(jù)處理57-58
• 2.4.5 構(gòu)建各類組裝中間體的原子模型58-59
• 2.4.6 構(gòu)建各組裝中間體原子模型的溫度圖譜（Temperature Map）59-60
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果60-89
• 2.5.0 成熟 50S大亞基的提取、純化60-61
• 2.5.1 成熟 50S大亞基結(jié)構(gòu)解析61-64
• 2.5.2 45S核糖體的純化、驗(yàn)證64-66
• 2.5.3 不成熟 45S亞基蛋白質(zhì)組成的定量質(zhì)譜分析66-70
• 2.5.4 不成熟 45S核糖體顆粒的二維圖像分析70-72
• 2.5.5 不成熟 45S組裝中間體的冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)分析72-78
• 2.5.6 45S組裝中間體的功能中心是高度不穩(wěn)定的78-81
• 2.5.7 45S組裝中間體 23S rRNA的結(jié)構(gòu)域IV和V沒有完成正確組裝81-84
• 2.5.8 H38的重定向是 50S亞基組裝后期關(guān)鍵的限速步驟84-86
• 2.5.9 體內(nèi) 50S大亞基后期組裝過程模型86-89
• 2.6 本章小結(jié)89-91
• 第3章 大亞基組裝因子YlqF與 50S亞基相互作用的研究91-108
• 3.1 引言91
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器91
• 3.3 實(shí)驗(yàn)材料與實(shí)驗(yàn)方法91-96
• 3.3.1 ylqF△N10菌株中不成熟 45S核糖體的純化與結(jié)構(gòu)解析91-92
• 3.3.2 枯草芽孢桿菌YlqF蛋白的過量表達(dá)與純化92-95
• 3.3.3 YlqF與 50S或 45S核糖體的結(jié)合驗(yàn)證以及二者復(fù)合物的獲得95-96
• 3.3.4 YlqF與 50S/45S復(fù)合物冷凍電鏡樣品制備、數(shù)據(jù)收集與數(shù)據(jù)處理96
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析96-106
• 3.4.1 ylqF△N10菌株中不成熟 45S核糖體結(jié)構(gòu)解析96-98
• 3.4.2 YlqF蛋白質(zhì)的過量表達(dá)、純化98-99
• 3.4.3 YlqF與50S/45S結(jié)合驗(yàn)證以及二者復(fù)合物的組裝99-102
• 3.4.4 YlqF與 45S組裝中間體復(fù)合物結(jié)構(gòu)102-104
• 3.4.5 YlqF與成熟 50S亞基復(fù)合物結(jié)構(gòu)104-105
• 3.4.6 YlqF在 50S亞基組裝過程中的功能分析105-106
• 3.5 本章小結(jié)106-108
• 第4章 其他工作：MecA-ClpC復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)研究108-114
• 4.1 引言108-109
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法109
• 4.2.1 MecA和ClpC突變體的純化與六聚體復(fù)合物的裝配109
• 4.2.2 冷凍電鏡樣品制備109
• 4.2.4 原子模型的柔性Fitting（Flexible Fitting）109
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析109-112
• 4.3.1 四種狀態(tài)復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)解析109-110
• 4.3.2 中央孔洞的可塑性和D1 loop的位置110-111
• 4.3.3 MecA的N端結(jié)構(gòu)域控制底物進(jìn)入ClpC解旋酶111
• 4.3.4 核苷酸水解誘導(dǎo)D1和D2兩層環(huán)狀結(jié)構(gòu)之間的相對旋轉(zhuǎn)111-112
• 4.4 本章小結(jié)112-114
• 第5章 討論與展望114-119
• 5.1 總結(jié)114-118
• 5.1.1 研究內(nèi)容總結(jié)114-116
• 5.1.2 相關(guān)討論：核糖體組裝的質(zhì)量控制機(jī)制116-117
• 5.1.3 冷凍電鏡技術(shù)在本研究中的重要作用117-118
• 5.2 展望118-119
• 5.2.1 YlqF作用機(jī)制方面118
• 5.2.2 大亞基組裝過程研究方面118-119
• 參考文獻(xiàn)119-133
• 致謝133-135
• 個人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果135

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本文編號：933489