本文關(guān)鍵詞：雞毒支原體MGA_0676蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 雞毒支原體 MGA_0676 細(xì)胞凋亡 NEDD8激活酶 NF-κB

【摘要】：雞毒支原體(Mycoplasma gallisepticum,M. gallisepticum)是引起雞呼吸困難、氣囊炎等癥狀的慢性呼吸道疾病的病原體,其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與其致病機(jī)制密切相關(guān)。支原體核酸酶樣蛋白是支原體重要的毒力蛋白,在其誘導(dǎo)細(xì)胞捌亡的過程中發(fā)揮重要作用。因此,研究雞毒支原體核酸酶樣蛋白對雞毒支原體的致病機(jī)制研究及雞毒支原體病的防控具有重要意義。 本研究將雞毒支原體MGA0676蛋白進(jìn)行序列分析及原核表達(dá)后,通過核酸酶切試驗(yàn)及酶譜試驗(yàn)對其核酸酶活性進(jìn)行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGA0676蛋白具有一個(gè)鏈球菌耐熱核酸酶(staphylococcal nuclease,SNC)功能區(qū),原核表達(dá)的rMGA_0676蛋白可以降解質(zhì)粒DNA、單鏈DNA及宿主細(xì)胞的核酸底物,具有Ca2+依賴性,在37℃及49℃具有較好的酶切活性,缺失SNC區(qū)的rMGA_0676△SNC蛋白不能降解核酸底物,這表明MGA0676蛋白是雞毒支原體具有Ca2+依賴性耐熱核酸酶,其核酸酶功能區(qū)為SNC區(qū)域。為研究MGA0676蛋白的生物學(xué)特性,利用膜蛋白免疫印跡及免疫膠體金電鏡技術(shù)鑒定其膜相關(guān)性,采用細(xì)胞Annexin V/PI方法及流式細(xì)胞術(shù)檢測體外MGA0676蛋白誘導(dǎo)雞胚細(xì)胞(DF-1)凋亡情況,采用激光共聚焦觀察MGA0676蛋白在細(xì)胞上的定位進(jìn)行觀察,同時(shí)采用HE、IHC及TUNEL方法對rMGA_0676蛋白處理后雛雞的組織病理變化進(jìn)行分析,并對SNC區(qū)域的功能進(jìn)行鑒定；結(jié)果發(fā)現(xiàn)MGA0676存在于雞毒支原體的膜蛋白中,分布于雞毒支原體膜表面,隨著rMGA_0676濃度(0.1μM、0.25μM、0.5μM)的增加及MGA0676蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)間(12h、24h、36h)的增長,MGA0676蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的量顯著性增加(p0.01),體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)rMGA_0676可以定位于雛雞氣管、肺、胸腺、脾臟及法氏囊組織并導(dǎo)致組織發(fā)生病變,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)發(fā)現(xiàn)其存在于DF-1細(xì)胞核周圍及細(xì)胞核,缺失了SNC功能區(qū)的MGA0676蛋白不能誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞凋亡,可以內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞,但不能進(jìn)入細(xì)胞核,上述結(jié)果表明MGA0676蛋白是雞毒支原體一個(gè)膜相關(guān)的蛋白質(zhì),定位于雞毒支原體的細(xì)胞表面,具有內(nèi)化及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能,其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡功能區(qū)為SNC區(qū),該區(qū)域影響MGA0676蛋白進(jìn)入細(xì)胞核,但不影響其內(nèi)化細(xì)胞。為進(jìn)一步研究MGA0676蛋白內(nèi)化細(xì)胞的特性及致病機(jī)理,采用間接免疫熒光及激光共聚焦技術(shù)對MGA0676內(nèi)化細(xì)胞的機(jī)理進(jìn)行研究,并對MGA0676蛋白的細(xì)胞靶蛋白采用pulldown、質(zhì)譜測序、免疫共沉淀及激光共聚焦技術(shù)進(jìn)行研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制Caveolin細(xì)胞內(nèi)吞途徑,抑制了rMGA_0676蛋白內(nèi)化DF-1細(xì)胞,雞毒支原體MGA0676蛋白與雞DF-1細(xì)胞的NEDD8激活酶調(diào)節(jié)亞基(NEDD8-activating enzyme E1regulatory subunit,NAE)蛋白相互作用,缺失了MGA0676蛋白的SNC區(qū)域或NAE蛋白的Thif區(qū)域均阻止了MGA0676蛋白與NAE蛋白的相互作用,這表明毒支原體MGA0676蛋白通過依賴于Caveolin的細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞,其SNC區(qū)域與雞DF-1細(xì)胞的NAE蛋白的Thif區(qū)域相互作用。為進(jìn)一步研究MGA0676蛋白與宿主NAE蛋白相互作用所引起的生物學(xué)效應(yīng)與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,采用小RNA干擾抑制DF-1細(xì)胞內(nèi)源性的NAE蛋白的表達(dá),證實(shí)MGA0676與其的相互作用對細(xì)胞凋亡的影響,并通過檢測細(xì)胞內(nèi)NF-κB活性,研究DF-1細(xì)胞NF-κB的激活與rMGA0676誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),抑制DF-1細(xì)胞NAE表達(dá)阻止了rMGA_0676蛋白及雞毒支原體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,rMGA_0676蛋白可以激活宿主細(xì)胞NF-κB信號途徑,阻斷MGA0676與NAE相互作用抑制了rMGA_0676蛋白誘導(dǎo)的NF-κB的激活,抑制細(xì)胞內(nèi)源性的NF-κB,抑制了rMGA_0676蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,這表明雞毒支原體MGA0676蛋白與DF-1細(xì)胞NAE蛋白相互作用激活宿主細(xì)胞NF-κB信號通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。 本研究證實(shí)了雞毒支原體MGA0676蛋白是雞毒支原體一個(gè)膜相關(guān)的核酸酶蛋白,揭示了MGA0676蛋白引起的宿主細(xì)胞凋亡的分子致病機(jī)理,闡明了NAE及NF-κB在雞毒支原體MGA-0676蛋白在引起細(xì)胞凋亡中發(fā)揮的作用,為深入探討雞毒支原體引起的細(xì)胞凋亡的分子致病機(jī)理提供了重要的理論依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：雞毒支原體 MGA_0676 細(xì)胞凋亡 NEDD8激活酶 NF-κB
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 文獻(xiàn)綜述16-26
• 1.1 雞毒支原體病研究進(jìn)展16-21
• 1.1.1 雞毒支原體病原學(xué)16-17
• 1.1.2 雞毒支原體流行病學(xué)17
• 1.1.3 雞毒支原體病的臨床癥狀與病理變化17-18
• 1.1.4 雞毒支原體病的診斷18-19
• 1.1.5 雞毒支原體病的防治19-21
• 1.2 雞毒支原體致病機(jī)理21-22
• 1.2.1 雞毒支原體的病理反應(yīng)21
• 1.2.2 雞毒支原體的致病性21-22
• 1.2.3 雞毒支原體的免疫損傷機(jī)理22
• 1.2.4 雞毒支原體感染與細(xì)胞凋亡22
• 1.3 支原體與細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展22-24
• 1.3.1 支原體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡22-23
• 1.3.2 宿主NF-κB信號通路與支原體誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡23-24
• 1.4 病原微生物核酸酶蛋白的研究進(jìn)展24-25
• 1.5 本研究目的和意義25-26
• 第二章 雞毒支原體MGA_0676原核表達(dá)及其性質(zhì)鑒定研究26-51
• 2.1 引言26
• 2.2 材料和方法26-41
• 2.2.1 雞毒支原體26
• 2.2.2 載體及菌株26
• 2.2.3 主要試劑及酶26
• 2.2.4 主要溶劑及其配制26-29
• 2.2.5 主要儀器設(shè)備29
• 2.2.6 雞毒支原體的培養(yǎng)29
• 2.2.7 雞毒支原體基因組DNA提取29-30
• 2.2.8 MGA_0676基因的擴(kuò)增與定點(diǎn)突變30-32
• 2.2.9 MGA_0676蛋白結(jié)構(gòu)分析預(yù)測32-33
• 2.2.10 pET-28a-MGA_0676及pET-28a-MGA_0676~(△SNC)的構(gòu)建33-35
• 2.2.11 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化35-37
• 2.2.12 重組蛋白濃度測定37
• 2.2.13 重組蛋白的免疫印跡鑒定37-38
• 2.2.14 重組蛋白性質(zhì)的鑒定38-40
• 2.2.15 本章節(jié)技術(shù)路線40-41
• 2.3 結(jié)果41-49
• 2.3.0 MGA_0676基因的克隆及其點(diǎn)突變結(jié)果41
• 2.3.1 MGA_0676蛋白結(jié)構(gòu)分析41-43
• 2.3.2 pET-28a-MGA_0676和pET-28a-MGA_0676~(△SNC)載體的構(gòu)建及鑒定43-44
• 2.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析44-45
• 2.3.4 重組蛋白的純化與鑒定45-46
• 2.3.5 蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制46-47
• 2.3.6 MGA_0676蛋白核酸酶活性檢測47-49
• 2.4 討論49-50
• 2.5 小結(jié)50-51
• 第三章 雞毒支原體MGA_0676蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及內(nèi)化細(xì)胞研究51-76
• 3.1 引言51
• 3.2 材料和方法51-64
• 3.2.1 試驗(yàn)材料51-54
• 3.2.2 試驗(yàn)方法54-64
• 3.3 結(jié)果64-74
• 3.3.1 MGA_0676及其突變體(MGA_0676~(△SNC))真核表達(dá)載體構(gòu)建64-65
• 3.3.2 MGA_0676是雞毒支原體膜相關(guān)的脂蛋白65-66
• 3.3.3 MGA_0676體外誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞凋亡66-68
• 3.3.4 MGA_0676體內(nèi)誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞凋產(chǎn)68-69
• 3.3.5 MGA_0676功能區(qū)SNC區(qū)域是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性區(qū)69-71
• 3.3.6 MGA_0676功能區(qū)SNC區(qū)域是其核定位的重要區(qū)域71-72
• 3.3.7 MGA_0676內(nèi)化及誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡72-74
• 3.4 討論74-75
• 3.5 小結(jié)75-76
• 第四章 雞毒支原體MGA_0676內(nèi)化細(xì)胞機(jī)理研究76-88
• 4.1 引言76
• 4.2 材料和方法76-81
• 4.2.1 試驗(yàn)材料76-77
• 4.2.2 試驗(yàn)方法77-81
• 4.3 結(jié)果81-86
• 4.3.1 MGA_0676蛋白內(nèi)化細(xì)胞具有劑量依賴性與時(shí)間依賴性81-82
• 4.3.2 Caveolin抑制劑Filipin對MGA_0676蛋白內(nèi)化細(xì)胞影響82-83
• 4.3.3 激光共聚焦觀察抑制劑對MGA_0676蛋白內(nèi)化細(xì)胞的影響83-84
• 4.3.4 小干擾RNA抑制Caveolin途徑影響MGA_0676蛋白內(nèi)化細(xì)胞84-85
• 4.3.5 MGA_0676蛋白與Caveolin在DF-1細(xì)胞內(nèi)共定位85-86
• 4.4 討論86-87
• 4.5 小結(jié)87-88
• 第五章 雞毒支原體MGA_0676蛋白與DF-1細(xì)胞相互作用研究88-105
• 5.1 引言88
• 5.2 材料和方法88-96
• 5.2.1 試驗(yàn)材料88-90
• 5.2.2 試驗(yàn)方法90-96
• 5.3 結(jié)果96-103
• 5.3.1 pulldown篩選與MGA_0676相互作用的DF-1細(xì)胞蛋白96
• 5.3.2 生物信息學(xué)分析MGA_0676與宿主細(xì)胞蛋白相互作用96-97
• 5.3.3 NAE基因RT-PCR擴(kuò)增及其載體構(gòu)建97-98
• 5.3.4 原核表達(dá)及純化NAE98-99
• 5.3.5 免疫印跡檢測NAE高免血清99
• 5.3.6 免疫共沉淀驗(yàn)證MGA_0676蛋白與細(xì)胞NAE蛋白相互作用99-100
• 5.3.7 激光共聚焦顯微鏡觀察MGA_0676和NAE在細(xì)胞中共定位100-102
• 5.3.8 MGA_0676蛋白SNC區(qū)域與NAE蛋白的Thif區(qū)域相互作用102-103
• 5.4 討論103-104
• 5.5 小結(jié)104-105
• 第六章 雞毒支原體MGA_0676與NAE相互作用對細(xì)胞凋亡的影響105-112
• 6.1 引言105
• 6.2 材料和方法105-108
• 6.2.1 試驗(yàn)材料105-106
• 6.2.2 試驗(yàn)方法106-108
• 6.3 結(jié)果108-111
• 6.3.1 篩選最優(yōu)的抑制DF-1細(xì)胞NAE表達(dá)的小干擾RNA序列108
• 6.3.2 細(xì)胞NAE表達(dá)抑制對MGA_0676及雞毒支原體誘導(dǎo)細(xì)胞病變影響108-109
• 6.3.3 細(xì)胞NAE表達(dá)抑制對MGA_0676及雞毒支原體誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響109-111
• 6.4 討論111
• 6.5 小結(jié)111-112
• 第七章 雞毒支原體MGA_0676蛋白激活NF-κB誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用機(jī)制112-127
• 7.1 引言112
• 7.2 材料和方法112-118
• 7.2.1 試驗(yàn)材料112-113
• 7.2.2 試驗(yàn)方法113-118
• 7.3 結(jié)果118-125
• 7.3.1 MGA_0676蛋白激活DF-1細(xì)胞NF-κB118-120
• 7.3.2 雞毒支原體激活DF-1細(xì)胞NF-κB120-121
• 7.3.3 免疫印跡檢測MGA_0676與NAE相互作用激活DF-1細(xì)胞NF-κB121
• 7.3.4 激光共聚焦檢測MGA_0676與NAE互作對DF-1細(xì)胞Rela的轉(zhuǎn)位121-123
• 7.3.5 免疫印跡檢測DF-1細(xì)胞Rela干擾結(jié)果123
• 7.3.6 NF-κB激活對MGA_0676蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響123-125
• 7.4 討論125
• 7.5 小結(jié)125-127
• 第八章 結(jié)論127-128
• 第九章 創(chuàng)新點(diǎn)128-129
• 參考文獻(xiàn)129-139
• 致謝139-140
• 作者簡歷140

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：905474