本文關(guān)鍵詞：基于多種非線性效應(yīng)的超分辨成像研究

  更多相關(guān)文章： 超分辨 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 STED nanobody 熒光漂白

【摘要】：由于光學(xué)顯微鏡可以無損的對生物樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測成像，是生物學(xué)家不可缺少的工具，而光學(xué)顯微鏡的發(fā)展也伴隨著生命科學(xué)的進(jìn)步。而由于光學(xué)衍射極限使得光學(xué)顯微鏡的分辨率被限制在200nm左右，阻礙了生物學(xué)家們進(jìn)行更精細(xì)的研究。最近二十年超分辨顯微鏡的出現(xiàn)則打破了光學(xué)衍射極限的限制，為生物學(xué)家們提供了有力的研究工具。在本論文中提出了幾種基于非線性效應(yīng)的超分辨技術(shù)的方法，旨在提供更高的成像分辨率和更簡單的超分辨成像方法。主要成果如下： (1)在一臺(tái)商業(yè)化的激光掃描共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上搭建出一臺(tái)受激發(fā)射損耗(STED)超分辨顯微鏡。我們利用STED對100nm的黃綠色熒光小球、細(xì)胞微管以及DNA折紙結(jié)構(gòu)進(jìn)行了成像，成像結(jié)果表明STED顯微鏡的分辨率優(yōu)于100nm。在Hela細(xì)胞里分別標(biāo)記溶酶體上的Lamp1蛋白和網(wǎng)格蛋白，然后使用激光共聚焦模式和STED模式對其進(jìn)行成像。成像結(jié)果表明STED的分辨率和對比度都要優(yōu)于激光共聚焦顯微鏡，搭建的STED系統(tǒng)可以應(yīng)用于細(xì)胞樣品。 （2）提出一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的STED成像方法。利用這種方法，即使在熒光峰發(fā)射距離STED的損耗光波長很遠(yuǎn)的情況下，STED依然可以有效地提升分辨率。我們首先建立了理論模型，然后又用Alexa405和atto488作為FRET對探針在實(shí)驗(yàn)上對理論進(jìn)行了驗(yàn)證。 （3）提出了利用時(shí)間門來提升FRET顯微鏡的分辨率的超分辨成像方法。在FRET對中由于受體飽和而引起在不同激發(fā)光強(qiáng)條件下供體的熒光壽命不同。利用時(shí)間門技術(shù)可以將這里的光子發(fā)射時(shí)間信息來編碼光子的空間信息，從而提升顯微鏡的分辨率。通過這種時(shí)間門FRET顯微術(shù)，可以提升FRET顯微鏡的三維空間分辨率。另外，考慮到STED損耗光也可以改變熒光分子的激發(fā)態(tài)熒光壽命，我們將一束損耗光施加在受體上來調(diào)制受體的激發(fā)態(tài)壽命，從而進(jìn)一步調(diào)制供體的激發(fā)態(tài)壽命。模擬結(jié)果表明施加了STED損耗光之后顯微鏡的分辨率得到明顯的提升。理論上，，即使STED的損耗光強(qiáng)是有限的，也可以通過設(shè)置門限時(shí)間來得到無限高的分辨率。 （4）首次提出了一種基于nanobody和熒光蛋白的高效率的FRET系統(tǒng)。通過nanobody作為中介將熒光蛋白和有機(jī)熒光染料連接構(gòu)成FRET系統(tǒng)。由于nanobody的體積較小使得供體和受體之間距離只有2nm,因而可以產(chǎn)生高效的FRET過程。我們在熒光分光光度計(jì)和激光共聚焦顯微鏡上驗(yàn)證了這個(gè)概念并測得nanobody FRET系統(tǒng)的FRET效率可以達(dá)到97%以上。我們通過將nanobody標(biāo)記在納米金剛石以及細(xì)胞微管上驗(yàn)證了此FRET體系。此外，通過在各種細(xì)胞器和胞內(nèi)蛋白以及各種熒光蛋白上進(jìn)行了測試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了此FRET體系具有良好的普適性。這種高效FRET探針可以用于那些基于高效的FRET超分辨顯微技術(shù)。 （5）提出了一種基于熒光漂白的超分辨成像方法。利用這種方法可以在普通的激光掃描共聚焦顯微鏡上實(shí)現(xiàn)超分辨成像而無需借助昂貴的超分辨顯微鏡。首先我們詳細(xì)的介紹了熒光漂白超分辨技術(shù)的理論原理，并使用MATLAB進(jìn)行理論模擬。在此理論基礎(chǔ)上我們進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證了熒光漂白超分辨技術(shù)。我們測試了幾種不同的熒光染料標(biāo)記熒光小球，取得了~60nm的分辨率，相比于普通顯微鏡提高了3-4倍。接著我們對細(xì)胞微管進(jìn)行漂白成像，獲得了~100nm的成像分辨率。我們同時(shí)使用Alexa405和atto488去標(biāo)記熒光小球以及細(xì)胞微管，然后使用不同的激發(fā)光進(jìn)行雙色熒光漂白超分辨成像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明這種方法可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)雙色超分辨成像。
【關(guān)鍵詞】：超分辨 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 STED nanobody 熒光漂白
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院研究生院（上海應(yīng)用物理研究所）
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：O439
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-9
• 目錄9-13
• 第一章 緒論13-47
• 1.1 超分辨顯微鏡13-22
• 1.1.1 光學(xué)顯微鏡與光學(xué)衍射極限13-14
• 1.1.2 超分辨光學(xué)顯微技術(shù)的發(fā)展14-19
• 1.1.3 超分辨光學(xué)顯微技術(shù)的成像19-21
• 1.1.4 超分辨的生物學(xué)應(yīng)用21-22
• 1.2 熒光與熒光共振能量轉(zhuǎn)移22-26
• 1.2.1 熒光(Fluorescence)22-23
• 1.2.2 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（ Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）23-24
• 1.2.3 FRET 效率的測量方法24-25
• 1.2.4 FRET 在生物學(xué)中的應(yīng)用25-26
• 1.3 Nanobody 介紹26-28
• 1.3.1 傳統(tǒng)抗體與 nanobody26-27
• 1.3.2 Nanobody 在生物學(xué)中的應(yīng)用27-28
• 1.4 總結(jié)及本課題的結(jié)構(gòu)28-29
• 參考文獻(xiàn)29-47
• 第二章 STED 搭建以及成像47-67
• 2.1 STED 的提出47-48
• 2.2 STED 光路的搭建48-50
• 2.3 STED 的光路校準(zhǔn)50-51
• 2.3.1 金顆粒樣品制作50
• 2.3.2 使用金顆粒對光路進(jìn)行校正50-51
• 2.4 熒光小球成像51-52
• 2.5 細(xì)胞微管成像52-57
• 2.5.1 atto 488 標(biāo)記的細(xì)胞微管樣品制作與 STED 成像52-54
• 2.5.2 STED 成像54-56
• 2.5.3 Chromeo 488 標(biāo)記的細(xì)胞微管樣品制作與 STED 成像56-57
• 2.5.4 STED 成像57
• 2.6 DNA 折紙結(jié)構(gòu) STED 成像57-60
• 2.6.1 折紙?jiān)O(shè)計(jì)58
• 2.6.2 樣品制作58-59
• 2.6.3 DNA 折紙結(jié)構(gòu)的 STED 成像59-60
• 2.7 溶酶體和網(wǎng)格蛋白的 STED 成像60-62
• 2.7.1 樣品制作60-61
• 2.7.2 STED 成像61-62
• 2.8 總結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-67
• 第三章 FRET-STED 聯(lián)用超分辨成像67-81
• 3.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）67
• 3.2 FRET-STED 超分辨原理67-71
• 3.2.1 理論68-70
• 3.2.2 STED 對供體熒光影響70-71
• 3.3 光路搭建71-74
• 3.3.1 光路校準(zhǔn)72-74
• 3.4 熒光小球成像74-78
• 3.4.1 樣品制作74-75
• 3.4.2 顯微鏡成像75-78
• 3.5 總結(jié)78-79
• 參考文獻(xiàn)79-81
• 第四章 基于 FRET 的時(shí)間門超分辨顯微鏡81-93
• 4.1 介紹81-82
• 4.2 FRET 時(shí)間門超分辨顯微成像理論82-85
• 4.3 時(shí)間門用于提升分辨率85-87
• 4.4 使用 STED 損耗光提升時(shí)間門 FRET 顯微鏡分辨率87-90
• 4.5 結(jié)果與討論90
• 參考文獻(xiàn)90-93
• 第五章 基于 nanobody 的高 FRET 效率熒光蛋白系統(tǒng)93-109
• 5.1 引言93-94
• 5.2 基于 nanobody 的 FRET 系統(tǒng)94-95
• 5.3 實(shí)驗(yàn)材料與方法95-96
• 5.3.1 Nanobody 標(biāo)記95-96
• 5.4 nanobody 標(biāo)記 GFP-納米金剛石成像96-98
• 5.4.1 樣品制作96-97
• 5.4.2 顯微鏡觀測97-98
• 5.5 細(xì)胞內(nèi)成像98-100
• 5.5.1 制樣步驟98-99
• 5.5.2 顯微鏡觀測99-100
• 5.6 受體漂白實(shí)驗(yàn)100-101
• 5.7 傳統(tǒng)抗體對照實(shí)驗(yàn)101-102
• 5.8 Nanobody FRET 系統(tǒng)應(yīng)用于不同的熒光蛋白和各種細(xì)胞器102-104
• 5.9 總結(jié)與討論104
• 參考文獻(xiàn)104-109
• 第六章 熒光漂白超分辨成像109-137
• 6.1 熒光漂白超分辨描述109-110
• 6.2 光漂白超分辨理論110-112
• 6.3 熒光小球樣品制作112-113
• 6.4 超分辨成像參數(shù)探索113-114
• 6.5 熒光小球漂白成像114-118
• 6.5.1 Atto 488 成像結(jié)果114-116
• 6.5.2 結(jié)果分析116-117
• 6.5.3 Alexa 405 熒光小球成像結(jié)果117-118
• 6.5.4 成像結(jié)果分析118
• 6.6 細(xì)胞微管成像118-124
• 6.6.1 Alexa405 標(biāo)記細(xì)胞微管樣品制作118-119
• 6.6.2 Alexa405 細(xì)胞微管成像結(jié)果119-120
• 6.6.3 成像結(jié)果分析120-121
• 6.6.4 Atto488 標(biāo)記的細(xì)胞微管成像121-122
• 6.6.5 Alexa 555 標(biāo)記的細(xì)胞微管成像122-123
• 6.6.6 Alexa 555 細(xì)胞微管成像結(jié)果123-124
• 6.6.7 成像結(jié)果分析124
• 6.7 熒光小球雙色標(biāo)記熒光漂白成像124-127
• 6.7.1 樣品制作124-126
• 6.7.2 熒光小球雙色熒光漂白成像126
• 6.7.3 成像結(jié)果分析126-127
• 6.8 細(xì)胞微管雙色成像127-130
• 6.8.1 樣品制作127-129
• 6.8.2 Alexa405 細(xì)胞微管成像結(jié)果129
• 6.8.3 成像結(jié)果分析129-130
• 6.9 熒光小球二維熒光漂白超分辨130-131
• 6.9.1 數(shù)據(jù)處理方法130-131
• 6.10 結(jié)論131-133
• 參考文獻(xiàn)133-137
• 第七章 總結(jié)與展望137-139
• 攻讀博士期間發(fā)表論文139-141
• 致謝141-142

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 杜建聰;鄧素輝;侯尚國;喬玲玲;陳建芳;黃慶;樊春海;程亞;趙云;;Superresolution imaging of DNA tetrahedral nanostructures in cells by STED method with continuous wave lasers[J];Chinese Optics Letters;2014年04期

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本文編號(hào)：900030