本文關(guān)鍵詞：反式作用小分子干擾RNA基因TAS3α的功能調(diào)控元件分析及優(yōu)化

  更多相關(guān)文章： TAS3α syn-tasiRNA miR390 基因干擾 融合基因

【摘要】：人工微小RNA (artificial microRNA)和合成反式作用小分子干擾RNAs (syn-tasiRNAs)在植物基因功能研究中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。一個(gè)TAS基因可以同時(shí)產(chǎn)生多個(gè)tasiRNAs,因而TAS基因具有同時(shí)干擾多個(gè)靶基因的應(yīng)用前景,然而,其干擾效果仍不盡人意。本研究通過對(duì)擬南芥TAS3a產(chǎn)生tasiRNAs的限制性因子進(jìn)行分析,得到了優(yōu)化的TAS3a基因,且其對(duì)靶基因的干擾效果明顯,此結(jié)果在植物基因功能研究中具有一定的應(yīng)用價(jià)值。 基于我們建立的XVE誘導(dǎo)性多基因表達(dá)系統(tǒng),分析了miR390, AGO7, DRB4和SGS3四個(gè)作用因子對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNA的影響。結(jié)果顯示,與誘導(dǎo)表達(dá)AGO7, DRB4和SGS3相比,只有當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)miR390a時(shí),產(chǎn)生于TAS3a的沉默報(bào)告子syn-tasiRNA/PDS對(duì)靶基因PDS的干擾效果明顯增強(qiáng)。另外,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加,成熟miR390的表達(dá)量逐漸增加,相應(yīng)地,沉默報(bào)告子syn-tasiRNA/PDS的表達(dá)量逐漸增加,而靶基因PDS mRNA的表達(dá)量逐漸下降。這表明了miR390是TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的限制性因素。 提高tasiRNAs的表達(dá)量及其生成的同步性(in-phase)是增強(qiáng)tasiRNAs有效性的兩個(gè)重要因素。TAS3a基因產(chǎn)生tasiRNA的區(qū)域(兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)間)越長,其產(chǎn)生非同步性的無效tasiRNAs的幾率越高,造成脫靶效應(yīng)這樣的負(fù)效應(yīng)將越嚴(yán)重。為了減少非同步性tasiRNAs引起的脫靶效應(yīng),將TAS3a基因進(jìn)行截短,獲得截短型TAS3a基因。對(duì)其進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),與全長型TAS3a基因相比,截短型TAS3a基因可以更有效地干擾靶基因PDS的表達(dá)。 基于以上研究,在截短型TAS3a基因的內(nèi)含子中插入miR390a基因,得到優(yōu)化的TAS3a基因-截短型TAS3a-miR390a兩融合基因。對(duì)其進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)表達(dá)截短型TAS3a-miR390a兩融合基因和截短型TAS3a時(shí),前者產(chǎn)生的沉默報(bào)告子syn-tasiR/PDS對(duì)靶基因PDS的干擾效果明顯好于后者。另外,超表達(dá)TAS3a-miR390a兩融合基因?qū)CP家族的多個(gè)成員也有較理想的干擾效果。這些研究結(jié)果表明,TAS3a-miR390a兩融合基因作為優(yōu)化的TAS3a基因可以更有效地干擾單個(gè)或多個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)。 TAS3a的兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)間的區(qū)域越短,特異性越好,但過短的TAS3a基因可能會(huì)影響syn-tasiRNA的產(chǎn)生。構(gòu)建了一系列截短型TAS3a-miR390a兩融合基因,對(duì)其產(chǎn)生有效tasiRNAs的最短間距進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與野生型相比,當(dāng)兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)間的區(qū)域最短截短到可以產(chǎn)生一個(gè)21nt tasiRNAs時(shí),沉默報(bào)告子對(duì)靶基因PDS沒有明顯的干擾效果。當(dāng)兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)間的區(qū)域最短截短到可以產(chǎn)生兩個(gè)21nt tasiRNAs時(shí),沉默報(bào)告子對(duì)靶基因PDS有明顯的干擾效果。這表明TAS3a基因的兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)間的最短間距為能容納兩個(gè)21nt tasiRNAs的長度。 為了產(chǎn)生更多有效的syn-tasiRNAs,嘗試使用miR173靶點(diǎn)替代TAS3a的3'-miR390靶點(diǎn),將miR390a基因和miR173基因融合并插入到TAS3a基因的內(nèi)含子中,得到：TAS3a, TAS1c, miR390a和miR173四基因融合體。在四基因融合體中,TAS3a和TAS1c的syn-tasiRNAs產(chǎn)生區(qū)域分別位于miR390靶點(diǎn)與miR173靶點(diǎn)間和miR173靶點(diǎn)后面。對(duì)其進(jìn)行功能驗(yàn)證,結(jié)果顯示位于miR173靶點(diǎn)后面的沉默報(bào)告子對(duì)靶基因有強(qiáng)的干擾效果,表明TAS3a和TAS1c融合后可以按照各自的機(jī)制產(chǎn)生有效的syn-tasiRNAs,并且四基因融合體可用于同時(shí)干擾多個(gè)基因的表達(dá)。同時(shí),也驗(yàn)證了TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的最短間距是兩個(gè)21nt tasiRNA的長度。 總之,通過對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響因素進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)miR390是其限制性因素,TAS3a產(chǎn)生有效syn-tasiRNA的區(qū)域長度至少能夠容納2個(gè)syn-tasiRNAs。在此基礎(chǔ)上得到了優(yōu)化的TAS3a基因,包括TAS3a-miR390a兩融合基因和TAS3a-TAS1c-miR390a-miR173四基因融合體,可以為影響植物生長發(fā)育,種子萌發(fā),以及致死的基因的功能研究提供干擾手段。
【關(guān)鍵詞】：TAS3α syn-tasiRNA miR390 基因干擾 融合基因
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q943.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• ~.略詞8-12
• 第一章 文獻(xiàn)綜述12-30
• 1.1 小RNA參與的基因沉默12
• 1.2 miRNA和siRNA的產(chǎn)生及功能研究12-15
• 1.2.1 miRNA的產(chǎn)生與功能研究13-14
• 1.2.2 siRNA的產(chǎn)生與功能研究14-15
• 1.3 小RNA介導(dǎo)的基因沉默機(jī)制15-17
• 1.3.1 小RNA介導(dǎo)的基因沉默方式15-16
• 1.3.2 小RNA對(duì)目標(biāo)mRNA的作用16-17
• 1.4 小RNA的基因干擾應(yīng)用17-20
• 1.4.1 siRNA的基因干擾應(yīng)用17-18
• 1.4.2 人工miRNA(amiRNA)的干擾應(yīng)用18
• 1.4.3 基因沉默的特異性18-19
• 1.4.4 基因沉默的系統(tǒng)效應(yīng)19-20
• 1.5 TAS基因的功能研究及應(yīng)用20-29
• 1.5.1 TAS基因的定義與分類20-21
• 1.5.2 具有單個(gè)miRNA靶位點(diǎn)的TAS1/2/4基因21-24
• 1.5.3 具有雙miRNA靶位點(diǎn)的TAS3基因24-26
• 1.5.4 TAS通路中的相關(guān)蛋白質(zhì)26-28
• 1.5.5 syn-tasiRNAs的基因干擾應(yīng)用28-29
• 1.6 本研究的目的和意義29-30
• 第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法30-52
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料30-32
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒30
• 2.1.2 常用分子生物學(xué)試劑及耗材30
• 2.1.3 植物材料30
• 2.1.4 常用培養(yǎng)基的配制30-31
• 2.1.5 常用抗生素的配制31
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)溶液的配制31-32
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法32-52
• 2.2.1 載體構(gòu)建方法32-37
• 2.2.2 植物多基因表達(dá)載體構(gòu)建方法37-38
• 2.2.3 植物材料培養(yǎng)方法38-39
• 2.2.4 植物材料檢測方法39-45
• 2.2.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建流程45-52
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析52-98
• 3.1 miR390對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響分析52-58
• 3.2 AG07對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響分析58-61
• 3.3 DRB4對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響分析61-64
• 3.4 SGS3對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響分析64-67
• 3.5 截短型TAS3a可以有效干擾目標(biāo)基因的表達(dá)67-74
• 3.6 TAS3a-miR390a兩融合基因的功能分析74-80
• 3.7 TAS3a-miR390a融合基因?qū)位蚝投嗷虻母蓴_應(yīng)用80-86
• 3.8 TAS3a兩個(gè)miR390靶位點(diǎn)之間的最短間距分析86-90
• 3.9 TAS3a,TAS1c,miR390a和miR173四基因融合體可以干擾基因表達(dá)90-93
• 3.10 截短型四基因融合體可以干擾多基因93-98
• 第四章 討論98-104
• 4.1 本研究的應(yīng)用價(jià)值98
• 4.2 miR390是TAS3a超表達(dá)產(chǎn)生有效tasiRNAs的限制性因子98-99
• 4.3 TAS3a tasiRNAs產(chǎn)生區(qū)域的最短距離為產(chǎn)生2個(gè)21 nt tasiRNA的長度99-100
• 4.4 miR390a可以在TAS3a的內(nèi)含子中進(jìn)行表達(dá)100-101
• 4.5 tasiRNAs本身的序列特征對(duì)TAS3a產(chǎn)生有效tasiRNAs的影響101
• 4.6 TAS3a,TAS1c,miR390a和miR173四融合基因?qū)Χ鄠�(gè)靶基因有干擾效果101-104
• 第五章 結(jié)論與展望104-106
• 附錄一 Crispr/Cas9系列載體在擬南芥多基因突變體中的應(yīng)用106-116
• 2.1 研究背景106
• 2.2 本研究的目的和意義106-107
• 2.3 實(shí)驗(yàn)材料107
• 2.4 實(shí)驗(yàn)方法107
• 2.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析107-114
• 2.5.1 包含Crispr-Cas9表達(dá)框的雙元表達(dá)載體構(gòu)建107
• 2.5.2 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥的突變分析107-110
• 2.5.3 T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥的突變分析110-114
• 2.6 結(jié)論與討論114-116
• 附錄二 文章中所需引物序列116-122
• 參考文獻(xiàn)122-132
• 致謝132-133
• 個(gè)人簡歷133

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：898523