本文關(guān)鍵詞：棕色固氮菌褐藻膠誘導(dǎo)大豆生成大豆抗毒素的研究

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【摘要】：源于細(xì)菌如固氮菌(Azotobacter)的褐藻膠往往有著優(yōu)于海藻褐藻膠的品質(zhì),可用作植物外源誘導(dǎo)劑。與同樣能夠分泌褐藻膠的假單胞菌(Pseudomonas)相比,由于假單胞菌具有致病性且其產(chǎn)生的褐藻膠凝膠能力較弱,因此固氮菌成為生產(chǎn)褐藻膠的優(yōu)選菌種。采用發(fā)酵和提取等方法可從棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)培養(yǎng)液中制備出高品質(zhì)的褐藻膠。棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的生長(zhǎng)與代謝取決與培養(yǎng)基中的不同營(yíng)養(yǎng)成分。關(guān)于褐藻膠的研究大多集中其化學(xué)特性、理化性質(zhì)和食品應(yīng)用方面,例如化學(xué)結(jié)構(gòu)、分子大小、凝膠特性等等。目前尚未有關(guān)注細(xì)菌褐藻膠誘導(dǎo)植物化學(xué)活性物質(zhì)生成尤其是對(duì)大豆中生物活性成分的誘導(dǎo)作用的研究。通常情況下,植物對(duì)于抵抗外源侵染的最有效的手段是在體內(nèi)累積生成具有抗菌活性、低分子量的次級(jí)代謝物質(zhì)即所謂的植物抗毒素。植物抗毒素在植物防御機(jī)制上發(fā)揮的作用已經(jīng)由一些實(shí)驗(yàn)方法揭示出來。大豆中的異黃酮類植物抗毒素如大豆抗毒素glyceollin有著雌激素的功效,且被認(rèn)為具有潛在地降低人體某些疾病和預(yù)防癌癥的效果。本課題主要對(duì)棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)來源的褐藻膠對(duì)于大豆中大豆抗毒素glyceollin的誘導(dǎo)效果進(jìn)行了研究,具體闡述了從棕色固氮菌培養(yǎng)液中提取制備細(xì)菌褐藻膠的方法以及細(xì)菌褐藻膠誘導(dǎo)大豆生成大豆抗毒素glyceollin的實(shí)驗(yàn)過程和對(duì)大豆中大豆抗毒素glyceollin累積的誘導(dǎo)能力。實(shí)驗(yàn)中采用高效液相色譜(HPLC)法定性和定量檢測(cè)從棕色固氮菌培養(yǎng)液中提取的細(xì)菌褐藻膠樣品,采用超高效液相色譜串聯(lián)電噴質(zhì)譜(UPLC-ESI-MS)法檢測(cè)細(xì)菌褐藻膠酸解產(chǎn)物及誘導(dǎo)產(chǎn)生的大豆抗毒素glyceollin的分子量,采用薄層層析(TLC)法檢測(cè)細(xì)菌褐藻膠酸解酸解產(chǎn)物中古洛糖醛酸(G)和甘露糖醛酸(M)的含量。通過研究誘導(dǎo)劑細(xì)菌褐藻膠的濃度、大豆浸泡時(shí)間以及誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)濕度和培養(yǎng)時(shí)間,對(duì)誘導(dǎo)條件進(jìn)行了優(yōu)化,并比較了分別以細(xì)菌褐藻膠和米曲霉作為誘導(dǎo)劑在上述最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)大豆生成大豆抗毒素glyceollin的效果。棕色固氮菌的培養(yǎng)結(jié)果表明,棕色固氮菌培養(yǎng)液中細(xì)菌褐藻膠的量為6.25 mg/m L菌液,生成的細(xì)菌褐藻膠的分子量為2.5 x 105 Da。從TLC檢測(cè)結(jié)果可以看出細(xì)菌褐藻膠主要由G和M兩種單糖組成。棕色固氮菌分泌的細(xì)菌褐藻膠可誘導(dǎo)大豆中大豆抗毒素的合成,最佳誘導(dǎo)的條件為:細(xì)菌褐藻膠濃度0.24mg/m L,加入量30μL,大豆浸泡時(shí)間5h,培養(yǎng)溫度30℃,培養(yǎng)濕度40%,培養(yǎng)時(shí)間4d。在最佳誘導(dǎo)條件下,源于棕色固氮菌的細(xì)菌褐藻膠誘導(dǎo)大豆生成大豆抗毒素的累積量為1.775 mg/g大豆干重,而經(jīng)海藻褐藻膠誘導(dǎo)的大豆中大豆抗毒素的累積量為0.012 mg/g大豆干重,經(jīng)切口處理但未加誘導(dǎo)劑的大豆中大豆抗毒素的累積量為0.154 mg/g大豆干重。本實(shí)驗(yàn)中有關(guān)細(xì)菌褐藻膠的提取和制備以及用于誘導(dǎo)大豆抗毒素累積的研究方法,對(duì)于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)開發(fā)高抗氧化活性產(chǎn)品具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。盡管本研究確定了在最佳誘導(dǎo)條件下細(xì)菌褐藻膠對(duì)大豆中大豆抗毒素的誘導(dǎo)效果,但是大豆抗毒素在藥物制劑方面的潛在應(yīng)用價(jià)值及作為一種生物活性物質(zhì)在功能食品生產(chǎn)上的利用價(jià)值還需進(jìn)行深入研究與開發(fā)。本研究結(jié)果對(duì)于源于棕色固氮的細(xì)菌褐藻膠在醫(yī)藥制品及功能食品生產(chǎn)上的應(yīng)用具有重要的意義。
【關(guān)鍵詞】：棕色固氮菌 細(xì)菌褐藻膠 大豆 大豆抗毒素 誘導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：Q93;TQ929
【目錄】：

• 摘要6-7
• ABSTRACT7-17
• CHAPTER 1 INTRODUCTION17-19
• 1.1. General introduction and research objectives17-18
• 1.2. Research objectives18
• 1.3. Research hypothesis18
• 1.4. Scope and limitation of the study18
• 1.5. Expected results18-19
• CHAPTER 2 LITERATURE REVIEW19-35
• 2.1. Alginate background19-26
• 2.1.1. Chemical structure19-22
• 2.1.2. Physical properties of alginate22
• 2.1.3. Solubility22-23
• 2.1.4. Selective ion binding23-24
• 2.1.5. Ionic cross-linking and Gel formation24-25
• 2.1.6. Application of alginate25
• 2.1.7. The use of alginate in the paper industry25
• 2.1.8. In the food industry25-26
• 2.2. Welding of rods application26-28
• 2.2.1. Alginate used as binders to fish feed26-27
• 2.2.2. Mould release agents27
• 2.2.3. Applications in biotechnology27
• 2.2.4. Use of alginate in the textile industry27-28
• 2.2.5. Alginate application in medical and pharmaceutical industry28
• 2.2.6. The use of alginate in water treatment28
• 2.3 Azotobacter vinelandii28-31
• 2.3.1 Alginate production by Azotobacter vinelandii28-29
• 2.3.2 Life cycle of Azotobacter29-30
• 2.3.3. Biological function of alginate in both producing bacterial species30-31
• 2.4. Effect of culture conditions on alginate production31-35
• 2.4.1. Carbon source32
• 2.4.2. p H condition32
• 2.4.3. Temperature32-33
• 2.4.4. Nitrogen source33
• 2.4.5. Effect of agitation33
• 2.4.6. Oxygen consumption33-35
• CHAPTER 3 BACTERIAL ALGINATE PRODUCTION AND EXTRACTION FROM AZOTOBACTER VINELANDII35-54
• 3.1. INTRODUCTION35-36
• 3.1.2. Aim35
• 3.1.3. Bacterial alginate production and extraction from Azotobacter vinelandii35-36
• 3.2. Materials and Methods36-38
• 3.2.1. Microorganism36
• 3.2.2. Materials36
• 3.2.3. Azotobacter vinelandii seed production culture media36
• 3.2.4. Sterilization and incubation of culture36-37
• 3.2.5. Inoculum preparation37
• 3.2.6. Bacterial alginate production media37
• 3.2.7. Bacterial alginate extraction37
• 3.2.8. Preparation of bacterial alginate for spectrophotometric determination37-38
• 3.2.9. Spectrophotometric condition for bacterial alginate determination38
• 3.3. Alginate standard curve construction38-42
• 3.3.1. Culture time for bacterial alginate production38
• 3.3.2. HPLC condition for alginate standard sample and bacterial alginate analysis38-39
• 3.3.3. Molecular weight determination of bacterial alginate from Azotobacter39
• 3.3.4. Hydrolysis of bacterial alginate for determining (G and M)39-40
• 3.3.5. Thin layer chromatography (TLC) condition40
• 3.3.6. Ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS) condition40-41
• 3.3.7. Construction of guluronic / mannuronic (G and M) acid standard curve41
• 3.3.8. Results and discussion41
• 3.3.9. Bacterial alginate determination by spectrophotometric determination41-42
• 3.4. Alginate standard sample standard linear curve42-54
• 3.4.1. Result of incubation time experiment for bacterial alginate production42-44
• 3.4.2. Results of HPLC analysis of alginate standard sample & bacterial alginate44
• 3.4.3. Result of the relative molecular weight determination of bacterial alginate44-46
• 3.4.4. HPLC results of alginate standard sample & bacterial alginate sample after hydrolysis46-47
• 3.4.5. TLC result of standard sample of (G and M), alginate standard sample and the bacterial alginate sample after hydrolysis47-48
• 3.4.6. Results of UPLC-MS analysis of hydrolyzed bacterial alginate sample48-50
• 3.4.7. Construction of standard curves for β-D-mannuronic and α-L-guluronic acid50-51
• 3.4.8. Discussion51-53
• 3.4.9. Conclusion53-54
• CHAPTER 4 ELICITATION OF PHYTOCHEMICAL GLYCEOLLIN BY BACTERIAL ALGINATE EXTRACTED FROM AZOTOBACTER VINELANDII54-74
• 4.1. Introduction54-55
• 4.2. Experimental materials and methods55-56
• 4.2.1. Materials55
• 4.2.2. Chemicals55-56
• 4.2.3. Bacterial alginate elicitor produced by Azotobacter vinelandii56
• 4.3. Methods56-58
• 4.3.1. Elicitation activities56
• 4.3.2. Preparation of glyceollin for High performance liquid chromatography (HPLC) and Ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC) analysis56-57
• 4.3.3. High performance liquid chromatography (HPLC) and ultra-performance liquid chromatography-57
• 4.3.4. Optimal condition activities57
• 4.3.5. Effect of elicitor’s concentration upon glyceollin accumulation57-58
• 4.3.6. Effect of temperature upon glyceollin accumulation58
• 4.3.7. Effect of moisture upon glyceollin accumulation58
• 4.3.8. Effect of soak time upon glyceollin accumulation58
• 4.3.9. Effect of time course upon glyceollin accumulation in soybean seeds58
• 4.4. Statistical Analysis58-59
• 4.5. Results59-70
• 4.5.1. Construction of linear curve for glyceollin61-62
• 4.5.2. Result of elicitor’s concentration effect upon glyceollin induction62-63
• 4.5.3. Result of temperature effect in the accumulation of glyceollin63
• 4.5.4. Result of moisture effect in the accumulation of glyceollin63-64
• 4.5.5. Result of soak time effect upon glyceollin accumulation64-65
• 4.5.6. Result of time course effect in the accumulation of glyceollin65-67
• 4.5.7. Quantitation of phytochemical glyceollins67-68
• 4.5.8. Results of UPLC-MS analysis of glyceollin elicited by bacterial alginate68-69
• 4.5.9. Result of electrospray ionization (ESI-MS) mass spectrometry69-70
• 4.6. Comparative results obtained for A. oryzae and bacterial alginate elicitors70-74
• CHAPTER 574-79
• 5.1. Comprehensive summary and discussion74-78
• 5.2. Conclusion and recommendation78-79
• REFERENCES79-91
• APPENDIX I91-92
• APPENDIX II92-93
• ACKNOWLEDGEMENT93-94
• RESUME94-96

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本文編號(hào)：857440