發(fā)布時(shí)間：2017-09-06 09:34

  本文關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞干性功能的影響

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【摘要】：目的：通過體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證EPCs對(duì)MSCs自我更新能力的影響,進(jìn)而說明EPCs可能是MSCs干細(xì)胞巢細(xì)胞。 方法：體外C57BL/6J(野生型)小鼠骨髓腔分離及鑒定EPCs和MSCs,使用GFP標(biāo)記MSC, PKH26標(biāo)記EPCs。在6孔板內(nèi)均勻的種植MSCs細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞,使用克隆形成實(shí)驗(yàn),觀察不同條件下觀察克隆形成數(shù)量。細(xì)胞來源有：正常培養(yǎng)的MSCs和與EPCs共培養(yǎng)的MSCs兩種情況；同時(shí)使用克隆柱法取取5個(gè)大小及形態(tài)相似的克隆體,分單純克隆MSC細(xì)胞、與EPCs聯(lián)合、使用PBS聯(lián)合(對(duì)照組)三種情況,通過骨髓回植的方法,注射到Rag2-/-鼠的骨髓腔內(nèi),4周后,流式細(xì)胞分離技術(shù)提取鼠外周血中的GFP陽性的MSCs,再進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)(Secondary CFU-F),觀察克隆體的數(shù)目；同時(shí)取鼠的肝臟和肺臟,冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察GFP標(biāo)記的陽性MSCs的分布及表達(dá)情況,體內(nèi)進(jìn),步驗(yàn)證EPCs對(duì)MSCs的自我更新能力的影響。 結(jié)果：成功從C57BL/6J鼠骨髓腔分離了MSCs和EPCs, MSCs經(jīng)成成脂分化、成軟骨分化、成骨分化鑒定成功；EPCs經(jīng)血管形成實(shí)驗(yàn)(Tube formation)鑒定成功。GFP成功標(biāo)記了MSCs, PKH26成功標(biāo)記了EPCs。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn),與EPCs共培養(yǎng)后的MSCs的克隆體數(shù)目CFU-Fs比單純的MSCs的克隆體要多(P0.05)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),骨髓注射了與EPCs和MSCs的鼠外周血MSCs的克隆體(Secondary CFU-Fs)比單純注射了MSCs的鼠外周血MSCs的Secondary CFU-Fs要多。解剖小鼠,取鼠的肺臟及肝臟,行冰凍切片,熒光倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),骨髓注射了MSCs和EPCs后的鼠肺臟和肝臟的GFP標(biāo)記的陽性MSCs的數(shù)量要比單純注射了MSCs的鼠的表達(dá)多(P0.05)。 結(jié)論：在體內(nèi)及體外,EPCs均能調(diào)控MSCs的自我更新,很可能是MSCs干細(xì)胞巢細(xì)胞組成之一。 目的：探討纖維粘連蛋白(Fibronectin, FN)及其下游受體整合素α5β1在在干細(xì)胞巢內(nèi)粘附過程中的作用。 方法：通過第一部分中的方法,獲得,使用ELISA方法檢測(cè)二者的培養(yǎng)基中FN的表達(dá)情況,使用免疫熒光的方法觀察FN在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)觀察將MSCs與EPCs體外粘附顯現(xiàn)：使用FN-siRNA干擾MSCs與EPCs中FN的表達(dá),進(jìn) 一步觀察粘附現(xiàn)象。使用MSCs和EPCs的無血清及無因子的空白培養(yǎng)基分別刺激對(duì)方細(xì)胞,使用Realtime-PCR和Westernbloting檢測(cè)二者FN及其下游受體的表達(dá)情況。 結(jié)果：MSCs與EPCs的培養(yǎng)基中均表達(dá)FN,后者比前者表達(dá)量要多(P0.05)；免疫熒光觀察FN在二者中均有表達(dá),主要分布在細(xì)胞漿及細(xì)胞膜上,二者在體外共培養(yǎng)體系中發(fā)生粘附。成功使用FN-siRNA干擾MSCs與EPCs中FN的表達(dá),使其表達(dá)下調(diào),觀察二者粘附顯著下降,甚至不粘附。RT-PCR結(jié)果顯示,EPCs的無血清及無因子的空白培養(yǎng)基可使MSCs細(xì)胞內(nèi)的α5β1表達(dá)上調(diào)；MSCs的無血清及無因子的空白培養(yǎng)基可使EPCs細(xì)胞內(nèi)的FN表達(dá)上調(diào)。 結(jié)論：EPCs可通過旁分泌FN與其下游的整合素α5β1受體作用,介導(dǎo)MSCs與EPCs的巢內(nèi)粘附,從而錨固MSCs。 目的：初步探討Wnt/β-catenin通路在EPCs促進(jìn)MSCs自我更新中的作用研究。 方法：在體外進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)(CFU-F),觀察加入培養(yǎng)過EPCs細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)克隆形成數(shù)量的影響：使用Wnt/β-catenin通路的抑制劑XAV939干預(yù)克隆形成的培養(yǎng)基,觀察克隆形成數(shù)量：使用RT-PCR和Western-blot方法檢測(cè)過EPCs細(xì)胞的培養(yǎng)基對(duì)MSCs的胞內(nèi)β-catenin因子mRNA和蛋白的表達(dá)影響,以此淺探EPCs對(duì)MSCs自我更新的影響及其可能機(jī)制。 結(jié)果：加入培養(yǎng)過EPCs細(xì)胞的培養(yǎng)基的形成克隆數(shù)量要多于正�？寺⌒纬膳囵B(yǎng)的克隆數(shù)(P0.05)；使用Wnt/β-catenin通路的抑制劑XAV939的克隆形成數(shù)明顯下降；RT-PCR結(jié)果提示EPCs可上調(diào)MSCs β-catenin因子mRNA的表達(dá)(P0.05)；Western-blot結(jié)果提示EPCs可上調(diào)MSCs胞內(nèi)β-catenin因子蛋白的表達(dá)。 結(jié)論：Wnt/β-catenin通路參與了EPCs促進(jìn)MSCs自我更新的過程。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 血管內(nèi)皮前體細(xì)胞 自我更新 干細(xì)胞巢 調(diào)控 內(nèi)皮前體細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞 粘附 干細(xì)胞巢 纖維粘連蛋白 整合素 間充質(zhì)干細(xì)胞 內(nèi)皮前體細(xì)胞 自我更新 Wnt/β-catenin通路 XAV939
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R329.2
【目錄】：

• 前言7-18
• 參考文獻(xiàn)13-18
• 第一部分：血管內(nèi)皮前體細(xì)胞可能是間充質(zhì)干細(xì)胞巢細(xì)胞的證據(jù)研究18-39
• 中文摘要18-19
• 英文摘要19-20
• 引言20-21
• 實(shí)驗(yàn)材料21-22
• 實(shí)驗(yàn)方法22-25
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法25-26
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果26-34
• 討論34-36
• 參考文獻(xiàn)36-39
• 第二部分：FN-整合素α5β1介導(dǎo)MSCs和EPCs粘附機(jī)制研究39-65
• 中文摘要39-40
• 英文摘要40-41
• 引言41-42
• 實(shí)驗(yàn)材料42-45
• 實(shí)驗(yàn)方法45-51
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法51-52
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-60
• 討論60-63
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 第三部分：Wnts信號(hào)通路在EPCs調(diào)控MSCs自我更新中的作用65-82
• 中文摘要65-66
• 英文摘要66-67
• 引言67-68
• 實(shí)驗(yàn)材料68-70
• 實(shí)驗(yàn)方法70-75
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果75-77
• 討論77-79
• 參考文獻(xiàn)79-82
• 文獻(xiàn)綜述82-107
• 參考文獻(xiàn)95-107
• 附錄一：英文縮略詞107-109
• 附錄二：發(fā)表文章109-110
• 致謝110-111

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本文編號(hào)：802351