本文關(guān)鍵詞：新型木質(zhì)纖維素復(fù)合酶系協(xié)同降解效果及機(jī)理研究

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【摘要】：農(nóng)業(yè)廢棄物和能源作物等木質(zhì)纖維素原料是豐富的可再生資源。充分利用木質(zhì)纖維素原料發(fā)酵生產(chǎn)生物能源(乙醇、沼氣等)是目前木質(zhì)纖維素定向生物轉(zhuǎn)化利用的研究熱點(diǎn)。纖維素乙醇的生產(chǎn)工藝中,預(yù)處理和水解酶成本高是急需改善的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)�，F(xiàn)有預(yù)處理方式不能完全去除木質(zhì)素組分,殘留木質(zhì)素對(duì)后續(xù)水解酶的活力具有強(qiáng)的抑制作用,而且使其產(chǎn)生無(wú)效吸附。因此,研究木質(zhì)素酶的降解作用及與纖維素酶、半纖維素酶的協(xié)同降解效果,進(jìn)而在降低纖維素水解酶成本的同時(shí)實(shí)現(xiàn)高的可發(fā)酵糖得率,是纖維素乙醇生物加工過(guò)程中亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。本研究中,對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期篩選的一株耐低溫的高效木質(zhì)素選擇性降解菌株枝孢霉Ch2-2(Cladosporium cladosporioides Ch2-2),優(yōu)化確定了其木質(zhì)素酶的制備方法。通過(guò)優(yōu)化Ch2-2木質(zhì)素酶與商品纖維素酶和木聚糖酶的用量以及糖化溫度條件,獲得含有Ch2-2木質(zhì)素酶和商品木聚糖酶的高效木質(zhì)纖維素復(fù)合酶系,在以菊芋莖稈為底物、28℃常溫條件下,二者之間的協(xié)同系數(shù)高達(dá)4.7,同時(shí)還原糖量達(dá)10.1 mg/mL,可替代目前價(jià)格昂貴、溫度條件要求高的商品化纖維素酶。研究表明木質(zhì)素酶和木聚糖酶具有明顯的協(xié)同效果。通過(guò)宏基因組測(cè)序及信息分析,對(duì)木聚糖酶高產(chǎn)菌群EMSD5的天然協(xié)同降解模式進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,EMSD5木質(zhì)纖維素降解酶基因中,糖苷水解酶基因所占比例高達(dá)52.35%,表明糖苷水解酶為主要分泌酶。其中,乙酰木聚糖酯酶、木聚糖酶所占比例較多,表明前者通過(guò)水解半纖維素側(cè)鏈酯鍵,與木聚糖酶協(xié)同作用,促進(jìn)半纖維素的降解,是木質(zhì)纖維素降解的主要輔助酶；內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖水解酶所占比例較小,表明EMSD5高效降解酶系并非需要大量纖維素酶。獲得具有多種木質(zhì)纖維素酶功能結(jié)構(gòu)域的新基因資源,推斷纖維素酶、半纖維素酶、酯酶、輔助氧化酶之間均存在協(xié)同作用。此外,存在大量木質(zhì)纖維素酶催化結(jié)構(gòu)域帶有碳水化合物結(jié)合模塊CBM(11.92%),此類催化結(jié)構(gòu)域的來(lái)源包括酯酶、糖苷轉(zhuǎn)移酶、糖苷水解酶、氧化酶、多糖裂解酶,表明分泌攜帶碳水化合物結(jié)合模塊CBM的游離酶的催化機(jī)制在EMSD5降解木質(zhì)纖維素過(guò)程中發(fā)揮主要作用,是細(xì)菌菌群的降解新模式。同時(shí)發(fā)現(xiàn)EMSD5中存在編碼SusE類型的外膜蛋白結(jié)構(gòu)域與半纖維素酶類催化結(jié)構(gòu)域相連的催化模式,這在以前的研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。說(shuō)明高效木質(zhì)纖維素降解菌群EMSD5中,存在天然木質(zhì)纖維素降解新模式,這為木質(zhì)纖維素代謝途徑的人工合成提供了新的策略,為工業(yè)復(fù)合酶制劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。基于宏基因組測(cè)序信息,從EMSD5中擴(kuò)增得到來(lái)源于GH11家族的木聚糖酶新基因exyl-his,同時(shí)擴(kuò)增獲得來(lái)源于黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)的錳過(guò)氧化物酶基因pcmnp-his,分別在畢赤酵母中進(jìn)行分泌表達(dá)。利用獲得的純酶Exy1、PcMnP協(xié)同降解菊芋莖稈,首次提出并證明了木聚糖酶與錳過(guò)氧化物酶之間存在協(xié)同作用,為復(fù)合酶系協(xié)同機(jī)制的深入研究提供了新的視角。
【關(guān)鍵詞】：木質(zhì)纖維素復(fù)合酶系 協(xié)同作用 木聚糖酶 錳過(guò)氧化物酶 宏基因組
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：TQ223.122;Q939.9
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 縮略詞一覽表9-10
• 第一章 引言10-26
• 1.1 木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)及降解復(fù)合酶10-14
• 1.2 木質(zhì)纖維素降解酶的協(xié)同作用14-18
• 1.3 木質(zhì)纖維素降解酶的作用模式18-20
• 1.4 菌群的木質(zhì)纖維素代謝途徑20-22
• 1.5 宏基因組學(xué)分析技術(shù)22-23
• 1.6 本課題的研究目的及意義23-26
• 第二章 材料與方法26-40
• 2.1 菌株和質(zhì)粒26
• 2.2 培養(yǎng)基和試劑26-27
• 2.3 重組表達(dá)載體pPIC9K-pcmnp-his的構(gòu)建27-28
• 2.4 畢赤酵母GS115感受態(tài)制備28
• 2.5 重組載體pPIC9K-pcmnp-his轉(zhuǎn)化畢赤酵母28
• 2.6 畢赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選鑒定28-29
• 2.7 重組載體pPIC9K-pcmnp-his在畢赤酵母中的誘導(dǎo)表達(dá)29
• 2.8 錳過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)29
• 2.9 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)29-30
• 2.10 蛋白濃度的測(cè)定30
• 2.11 濾紙酶活(FPA,filter paper activity)的檢測(cè)30-31
• 2.12 外切葡聚糖酶活性的檢測(cè)31
• 2.13 內(nèi)切葡聚糖酶活性的測(cè)定31-32
• 2.14 木聚糖酶活性的檢測(cè)32
• 2.15 漆酶活性的檢測(cè)32
• 2.16 LiP活性的檢測(cè)32
• 2.17 復(fù)合酶水解體系的構(gòu)建32-33
• 2.18 協(xié)同系數(shù)的計(jì)算33
• 2.19 菌群EMSD5基因組DNA的提取33
• 2.20 菌群EMSD5的保存33
• 2.21 菌群EMSD5的活化33-34
• 2.22 菌群EMSD5產(chǎn)酶34
• 2.23 Ch2-2種子液制備34
• 2.24 Ch2-2液體產(chǎn)酶34
• 2.25 Ch2-2粗酶粉的制備34
• 2.26 復(fù)合酶體系的構(gòu)建34-35
• 2.27 還原糖濃度的測(cè)定35
• 2.28 重組蛋白的純化35-36
• 2.29 EMSD5宏基因組測(cè)序36-40
• 第三章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析40-100
• 3.1 包含木質(zhì)素酶的Ch2-2胞外酶與纖維素酶、木聚糖酶的協(xié)同降解效果40-55
• 3.1.1 枝孢霉Ch2-2木質(zhì)素酶粗酶的制備及其協(xié)同降解效果40-45
• 3.1.2 復(fù)合酶系的優(yōu)化及其中低溫適應(yīng)特性45-54
• 3.1.3 小結(jié)54-55
• 3.2 木質(zhì)纖維素降解菌群EMSD5的群落結(jié)構(gòu)和降解模式55-90
• 3.2.1 菌群EMSD5胞外酶活力檢測(cè)55-56
• 3.2.2 菌群EMSD5基因組DNA的提取56-57
• 3.2.3 數(shù)據(jù)預(yù)處理57
• 3.2.4 組裝57-59
• 3.2.5 基因預(yù)測(cè)59
• 3.2.6 物種注釋59-62
• 3.2.7 功能注釋62-85
• 3.2.8 木質(zhì)纖維素酶的降解模式分析85-89
• 3.2.9 小結(jié)89-90
• 3.3 錳過(guò)氧化物酶與木聚糖酶的協(xié)同作用90-100
• 3.3.1 攜帶His標(biāo)簽的錳過(guò)氧化物酶基因pcmnp-his的異源表達(dá)90-93
• 3.3.2 菌群EMSD5木聚糖酶新基因的擴(kuò)增93-95
• 3.3.3 攜帶His標(biāo)簽的木聚糖酶基因exyl-his的異源表達(dá)95-97
• 3.3.4 錳過(guò)氧化物酶PcMnP與木聚糖酶Exy1協(xié)同降解菊芋莖稈97-99
• 3.3.5 小結(jié)99-100
• 第四章 討論與展望100-104
• 4.1 討論100-102
• 4.2 創(chuàng)新點(diǎn)102-103
• 4.3 展望103-104
• 參考文獻(xiàn)104-114
• 致謝114-116
• 個(gè)人簡(jiǎn)介116

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本文編號(hào)：800681