發(fā)布時間：2017-09-05 19:41

  本文關(guān)鍵詞：利用細(xì)菌人工染色體制備乳過氧化物酶小鼠乳腺反應(yīng)器的研究

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【摘要】：乳腺生物反應(yīng)器是一種具有廣泛應(yīng)用前景的蛋白生產(chǎn)模式。構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體時常選用乳蛋白基因的啟動子,常用的乳蛋白基因包括酪蛋白、乳清酸蛋白、乳清白蛋白、乳球蛋白基因等。有研究表明乳鐵蛋白基因啟動子也可用于調(diào)控外源基因的乳腺特異表達(dá)。利用細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome, BAC)載體制備乳腺反應(yīng)器具有調(diào)控區(qū)完整、不受位置效應(yīng)影響、表達(dá)量可與插入拷貝數(shù)呈正相關(guān)等優(yōu)點。因此本研究用BAC載體進(jìn)行外源基因的小鼠乳腺反應(yīng)器的研究,驗證其作為穩(wěn)定高效的表達(dá)載體調(diào)控外源基因在乳腺中表達(dá)的能力。本研究選用牛乳過氧化物酶基因(bovine lactoperoxidase, bLPO)進(jìn)行小鼠乳腺反應(yīng)器模型制備。牛乳過氧化物酶與過氧化氫、硫氰化物共同組成具有天然抗菌作用的乳過氧化物酶系統(tǒng),除廣譜抗菌作用外還具有抗真菌、抗病毒、抗自由基、促進(jìn)免疫等生物功能,因此該蛋白在生產(chǎn)生活中有極高的應(yīng)用價值。本研究比較了攜帶有3種不同啟動子的BAC載體在小鼠中調(diào)控外源基因bLPO表達(dá)的能力。3種啟動子分別為bLPO自身啟動子、αs1酪蛋白啟動子、乳鐵蛋白啟動子。本研究制備了3種BAC載體調(diào)控bLPO表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠,鑒定了轉(zhuǎn)基因鼠中bLPO基因的插入與表達(dá)情況。結(jié)果表明bLPO自身啟動子不能調(diào)控bLPO蛋白在乳腺中表達(dá),僅在mRNA水平檢測到有少量表達(dá)；αs1酪蛋白啟動子、乳鐵蛋白啟動子均可調(diào)控bLPO的重組表達(dá)。乳鐵蛋白BAC載體表達(dá)的重組bLPO在個別個體中表達(dá)量最高,但αs1酪蛋白的BAC載體表達(dá)的重組bLPO在不同個體的平均表達(dá)量高于乳鐵蛋白BAC載體。Western blotting與去糖基化酶實驗表明重組bLPO與天然bLPO具有相似的N-糖基化修飾,但分子量略有差異。酪蛋白啟動子調(diào)控的轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中重組LPO的濃度為0.118 μg/μL～0.216 μg/μL之間,乳鐵啟動子轉(zhuǎn)基因小鼠乳中重組LPO的表達(dá)量在0.041μg/μL～0.364 μg/μL之間,兩種轉(zhuǎn)基因鼠乳汁中的重組bLPO均高于牛乳中bLPO的濃度(～0.03μg/μL)。本研究采用了ABTS法測定bLPO的酶活性,顯示1微升轉(zhuǎn)基因鼠乳中LPO酶活力(U/mL)在0.0198～0.0261之間,相當(dāng)于1微克標(biāo)準(zhǔn)品bLPO酶活力的56.1%～73.9%,酶活與bLPO的含量呈正相關(guān)。抑菌圈法檢測重組bLPO的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因鼠奶可以抑制大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的生長形成抑菌圈。本研究成功獲得了表達(dá)bLPO的轉(zhuǎn)基因鼠。αs1酪蛋白和乳鐵蛋白BAC載體均可在小鼠乳腺特異驅(qū)動表達(dá)bLPO, rbLPO表達(dá)水平最高達(dá)0.364μg/μL,說明BAC可以作為制備乳腺反應(yīng)器的有效載體提高外源基因的表達(dá)量,可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物模型制備、研究外源蛋白功能以及大規(guī)模生產(chǎn)乳腺反應(yīng)器等領(lǐng)域。
【關(guān)鍵詞】：細(xì)菌人工染色體 乳腺生物反應(yīng)器 乳過氧化物酶
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q81;Q78
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 縮略詞7-8
• 第一章 文獻(xiàn)綜述8-36
• 1.1 轉(zhuǎn)基因動物研究進(jìn)展8-21
• 1.2 乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展21-26
• 1.3 乳過氧化物酶概述26-35
• 1.4 目的和意義35-36
• 第二章 材料與方法36-58
• 2.1 實驗材料36
• 2.2 常用試劑與溶液36-39
• 2.3 實驗儀器及耗材39-40
• 2.4 實驗分析軟件40
• 2.5 實驗方法40-58
• 第三章 利用BAC載體在小鼠乳腺中表達(dá)乳過氧化物酶58-98
• 3.1 乳過氧化物酶BAC表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定58-66
• 3.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備66-67
• 3.3 乳過氧化物酶小鼠模型鑒定67-85
• 3.4 重組牛乳過氧化物酶的定量檢測與活性評價85-95
• 3.5 分析與討論95-98
• 第四章 結(jié)論98-99
• 參考文獻(xiàn)99-117
• 致謝117-118
• 附錄118-127
• 個人簡介127-128

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本文編號：799919