本文關(guān)鍵詞：核膜BK通道調(diào)節(jié)神經(jīng)元核鈣依賴性的基因表達(dá)及樹突分支

  更多相關(guān)文章： 離子通道 核鈣信號 BK通道 樹突分支

【摘要】：離子通道廣泛表達(dá)于細(xì)胞的磷脂膜結(jié)構(gòu)上,包括細(xì)胞膜,線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),溶酶體,以及細(xì)胞核膜等,并在細(xì)胞的多種生理活動中起到重要的調(diào)控作用。在神經(jīng)元生理和病理過程中,離子通道一直是研究的焦點。在神經(jīng)元胞膜上的離子通道參與神經(jīng)元的動作電位的產(chǎn)生和傳遞,以及神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。亦有的研究報道,在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)部,線粒體、溶酶體膜上有離子通道的表達(dá),它們調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子庫的鈣離子釋放,影響細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生理或病理過程。雖然細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器上的離子通道已經(jīng)受到許多科研工作者的關(guān)注,并得到大量研究,然而表達(dá)在細(xì)胞核膜上的離子通道和它們的生理意義卻仍然不清楚。細(xì)胞核常常被認(rèn)為是基因表達(dá)的控制中心。組成細(xì)胞核的主要結(jié)構(gòu)便是細(xì)胞核膜的雙層磷脂膜結(jié)構(gòu)——細(xì)胞核內(nèi)膜與細(xì)胞核外膜。近期的研究表明,核內(nèi)膜與核外膜之間包繞形成核周隙含有高濃度的鈣離子,是細(xì)胞內(nèi)的一個獨(dú)立于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)之外的功能性的鈣離子庫。這些鈣離子可以通過細(xì)胞核膜上的InsP3Rs或RyR等鈣離子通道被釋放到細(xì)胞核漿中,使細(xì)胞核鈣離子濃度升高。細(xì)胞核周隙有可能通過控制細(xì)胞核鈣離子水平參與對細(xì)胞核內(nèi)的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。但是目前為止,有哪些具體機(jī)制參與對細(xì)胞核周隙鈣離子釋放的調(diào)控仍然不清楚。我們研究組的前期工作證實了在海馬神經(jīng)元的細(xì)胞核膜上,表達(dá)有功能完整的大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(BK通道),這些細(xì)胞核膜BK通道能夠調(diào)節(jié)核膜電位,并且調(diào)控核周隙鈣離子的釋放,影響細(xì)胞核內(nèi)的鈣離子濃度。大量研究表明,細(xì)胞核鈣離子信號對于調(diào)節(jié)神經(jīng)活動依賴性的基因表達(dá)具有重要意義,并且介導(dǎo)一些長時程的適應(yīng)性改變,包括對突觸的形成和樹突復(fù)雜程度的調(diào)節(jié),對突觸可塑性以及記憶的鞏固過程的調(diào)節(jié)。在神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)可塑性、長時程記憶的形成,以及神經(jīng)元細(xì)胞存活等許多生理過程中,神經(jīng)活動通過鈣離子信號引起環(huán)化腺苷酸效應(yīng)原件結(jié)合蛋白CREB的鈣信號依賴性的活化,進(jìn)而調(diào)節(jié)這些生理過程。CREB是一個定位于細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子,那么必須存在某一種鈣離子敏感性的信號通路將突觸部位細(xì)胞漿的鈣信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)并引起CREB的磷酸化。因此,在這里我們深入探討了在神經(jīng)元興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程中,細(xì)胞核膜BK通道對于調(diào)節(jié)神經(jīng)活動依賴性的基因表達(dá)的作用。本研究發(fā)現(xiàn),神經(jīng)元核膜BK通道通過影響細(xì)胞核周隙的鈣離子釋放,調(diào)節(jié)CaMKIV依賴性的細(xì)胞核鈣離子信號通路,進(jìn)而調(diào)控神經(jīng)元活動誘導(dǎo)的CREB轉(zhuǎn)錄因子的活化,以及下游靶基因的表達(dá),并且影響了神經(jīng)元樹突分支。1.核膜BK通道通過CaMKIV依賴性的細(xì)胞核鈣離子信號通路調(diào)節(jié)CREB的磷酸化。我們前期的研究工作提示核膜BK通道能夠調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄活性,并且這一作用可能是通過控制細(xì)胞核鈣離子濃度來實現(xiàn)的。于是我們首先探討了核膜BK通道是否通過細(xì)胞核鈣離子信號通路來調(diào)控CREB轉(zhuǎn)錄活性。CREB的轉(zhuǎn)錄活性受到兩條鈣離子依賴的信號通路的調(diào)控,一條是Ca/calmodulin (CAM)-dependent protein kinases通路,特別是定位于細(xì)胞核內(nèi)的CaM kinase Ⅳ(CaMKⅣ),另一條是MAP kinase/extracellular signal-regulated kinase(ERK)信號通路。BK通道的特異性阻斷劑paxilline處理分離的神經(jīng)元細(xì)胞核后,用免疫印跡法檢測到CREB與CaMKIV磷酸化程度比對照組增強(qiáng),而ERK的磷酸化沒有發(fā)生改變。這提示CaMKIV通路可能介導(dǎo)了核膜BK通道對CREB的轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用。為了排除paxilline可能存在的非特異性作用給實驗結(jié)果帶來假陽性,我們同時在BK通道基因敲除(Kcnmal-/-)小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞核上平行做了以上實驗。結(jié)果顯示,在Kcnmal-/-小鼠的神經(jīng)元細(xì)胞核,paxilline既沒有改變CREB的磷酸化程度,也沒有改變CaMKIV或者ERK的磷酸化程度。這說明paxilline對分離細(xì)胞核的CREB與CaMKIV的磷酸化的調(diào)節(jié)作用是特異性地通過BK通道來實現(xiàn)的,而不是通過可能存在的其它非特異性靶點。為了進(jìn)一步證實CaMKIV信號通路參與核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用,我們分別用CaMKIV信號通路的特異性抑制劑STO-609來阻斷CaMKIV信號,和ERK信號通路的特異性抑制劑U0126來阻斷ERK信號通路,免疫熒光染色結(jié)果顯示,在分離的功能完整的細(xì)胞核上,CaMKIV信號通路的阻斷劑STO-609有效地阻斷了paxilline誘導(dǎo)的CREB磷酸化的升高(P=0.007),而ERK信號通路的阻斷劑U0126沒有影響paxilline對CREB磷酸化的促進(jìn)作用。這提示CaMKIV信號通路,而非ERK信號通路,介導(dǎo)了核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用。除了分離的細(xì)胞核外,我們在完整的培養(yǎng)海馬神經(jīng)元上也進(jìn)行了同樣的實驗。由于在完整細(xì)胞上,細(xì)胞質(zhì)膜也表達(dá)有大量的BK通道,因此為了排除細(xì)胞質(zhì)膜上BK通道對實驗結(jié)果造成干擾,所有細(xì)胞都用一種BK通道的不能穿透細(xì)胞膜的肽類阻斷劑IbTx進(jìn)行了預(yù)處理,阻斷細(xì)胞膜上的BK通道而不影響細(xì)胞內(nèi)的BK通道,以排除在完整細(xì)胞上細(xì)胞質(zhì)膜BK通道帶來的影響。STO-609阻斷了paxilline誘導(dǎo)的CREB磷酸化的升高(P=0.001),而ERK信號通路的阻斷劑U0126沒有影響這一作用。這些結(jié)果證實了核膜BK通道是通過CaMKIV信號通路而非ERK信號通路來調(diào)節(jié)CREB轉(zhuǎn)錄活性。通過對培養(yǎng)神經(jīng)元外源表達(dá)shRNA來降低CaMKIV表達(dá),我們進(jìn)一步驗證了阻斷CaMKIV信號通路產(chǎn)生的作用。同樣的,在降低CaMKIV表達(dá)以后,paxilline不能顯著提高CREB磷酸化程度(P=0.792),進(jìn)一步證明CaMKIV介導(dǎo)了核膜BK通道對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用。此外,我們通過另外兩種方式抑制CaMKIV依賴性的細(xì)胞核鈣信號通路,一種是外源表達(dá)一種定位于細(xì)胞核的并且能夠螯合鈣離子的蛋白質(zhì)PV-NLS(帶有核定位序列的parvalbumin)來緩沖細(xì)胞核內(nèi)的鈣濃度升高；另一種是外源表達(dá)一種CaMKIV的突變體dnCaMKIVK75E,這個突變體已經(jīng)失去了它的酶活性,因此是CaMKIV的一種顯性負(fù)性形式,能夠競爭性抑制內(nèi)源性CaMKIV的作用。同樣地,在外源表達(dá)了PV-NLS或者dnCaMKIVK75E的細(xì)胞,paxilline對CREB磷酸化的調(diào)節(jié)作用減弱了(PV-NLS與dnCaMKIVK75E組均為P=0.000)。以上證據(jù)表明,核膜BK通道通過調(diào)節(jié)核鈣濃度,以及CaMKIV依賴的核鈣信號通路,調(diào)控CREB的磷酸化。2.核膜BK通道參與調(diào)控神經(jīng)元活動誘導(dǎo)的CREB轉(zhuǎn)錄因子活化與基因表達(dá)。興奮性突觸活動能夠誘導(dǎo)細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子激活和一些基因表達(dá),這個過程稱為神經(jīng)元的興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)。興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)在很多生理過程中都發(fā)揮著重要作用,諸如神經(jīng)發(fā)育、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)元的細(xì)胞存活等等。我們想進(jìn)一步探討核膜BK通道是否參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程,因此我們研究了核膜BK通道是否參與了神經(jīng)元活動對CREB轉(zhuǎn)錄活性與基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。我們首先在培養(yǎng)神經(jīng)元上使用IbTx封閉細(xì)胞膜上的BK通道,以排除細(xì)胞膜BK通道可能帶來的影響后,我們使用GABA受體阻斷劑Bicuculine阻斷GABA系統(tǒng)對神經(jīng)元的抑制作用,通過這種手段提高錐體神經(jīng)元的興奮活動。bicuculine的處理可以誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞核內(nèi)鈣離子濃度上升,我們通過免疫熒光染色檢測到CREB磷酸化也得到增強(qiáng)(P=0.005)。但是經(jīng)過paxilline預(yù)處理過的神經(jīng)元在接受bicuculine處理后,細(xì)胞核鈣信號變化以及CREB活性增加幅度都有減弱(P=0.027)。這可能是由于神經(jīng)活動引發(fā)的細(xì)胞核鈣信號增強(qiáng)依賴于細(xì)胞核周隙鈣庫的充盈,而paxilline預(yù)處理促使細(xì)胞核周隙的鈣離子排出,減少了核周隙鈣庫中的鈣離子,因此減弱了bucuculine引發(fā)的細(xì)胞核鈣信號。這些實驗數(shù)據(jù)說明核膜的BK通道能夠調(diào)節(jié)興奮活動引起的細(xì)胞核鈣信號活動以及CREB磷酸化。為了排除paxilline的作用是由于非特異性地結(jié)合了BK通道以外的其它靶點的可能性,我們在BK基因敲除小鼠(Kcnmal-/-)培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元上做了相同的實驗,我們沒有檢測到paxilline對bicuculine誘導(dǎo)的細(xì)胞核鈣信號改變有任何影響,也沒有檢測到paxilline對bicuculine引起的CREB磷酸化產(chǎn)生抑制作用(P=0.623),這些結(jié)果表明paxilline的作用是特異性作用于BK離子通道的。為了探討核膜BK通道是否參與對調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)鈣信號依賴的基因表達(dá)的調(diào)節(jié),我們選取了一系列對細(xì)胞核鈣信號敏感的基因作為檢測指標(biāo)。所有神經(jīng)元用IbTx預(yù)處理以排除細(xì)胞質(zhì)膜BK通道的影響后,一部分用paxilline阻斷核膜BK通道,另一部分作為對照,然后通過qPCR檢測這些基因的mRNA水平,觀察它們的表達(dá)是否受影響,以判斷核膜BK通道是否有可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞核鈣信號敏感的基因表達(dá)。在基礎(chǔ)神經(jīng)活動水平下,paxilline確實能夠增強(qiáng)Fos(P=0.005), Npas4 (P=0.000), Atf3 (P=0.000), Btg2 (P=0.007), Bcl6(P=0.000),以及Ifi206b(P=0.005)等一些神經(jīng)活動依賴性基因的表達(dá)。Paxilline對神經(jīng)元基因表達(dá)的促進(jìn)的作用可以被CaMKIV信號通路特異性阻斷劑STO-609徹底阻斷(Fos, P=0.001; Npas4, P=0.001; Atf3, P=0.001; Btg2, P=0.048; Bcl6, P=0.003; Ifi206b, P=0.015).為了更進(jìn)一步驗證核膜BK通道對基因表達(dá)的作用,排除paxilline可能存在的非特異性影響,我們同樣在Kcnma-/-小鼠的神經(jīng)元上檢測了paxilline是否還能夠引起這些活動依賴性基因的表達(dá)。我們的實驗結(jié)果顯示在沒有BK通道的神經(jīng)元,paxilline不能引起這些基因表達(dá)的改變(Fos, P=0.896; Npas4, P=0.990; Atf3, P=0.896; Btg2, P=0.856; Bcl6, P=0.929; Ifi206b, P=0.929),排除了paxilline非特異性的可能。為了深入探討核膜BK通道是否參與神經(jīng)活動活動對基因表達(dá)的調(diào)節(jié),我們也使用bicuculine去除GABA系統(tǒng)的抑制作用,來提高環(huán)路興奮性,并檢測上述基因的表達(dá)。bucuculine的作用增強(qiáng)了Fos, Npas4, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b等基因的表達(dá)(Fos, t=-5.330,P=0.006; Npas4, t=-6.149, P=0.004; Atf3, t=-16.864, P=0.000; Btg2, t=-4.959, P=0.008; Bcl6, t=-6.180, P=0.003; Ifi206b,t=-4.648,P=0.010,獨(dú)立樣本t檢驗),而paxilline預(yù)處理則減弱了神經(jīng)活動引起的基因表達(dá)(Fos, t=4.054, P=0.027; Npas4, t=4.868, P=0.008; Atf3, t=6.882, P=0.002; Btg2, t=5.403, P=0.006; Bcl6, t=5.961, P=0.004; Ifi206b, t=6.441, P=0.003,獨(dú)立樣本t檢驗)。,我們推測這同樣是因為paxilline引起核周隙鈣庫的減少導(dǎo)致鈣信號減弱所致。綜合這些結(jié)果,我們認(rèn)為在神經(jīng)元興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程中,核膜BK通道對神經(jīng)活動引起的核鈣信號活動、CREB轉(zhuǎn)錄因子的激活,以及下游敏感基因的表達(dá)都具有重要的調(diào)控作用。3.核膜BK通道通過CaMKIV依賴性的核鈣信號通路和CREB介導(dǎo)的基因表達(dá),調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突分支。神經(jīng)元樹突的幾何形態(tài)是受到興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的高度調(diào)節(jié)的。前面的工作中我們發(fā)現(xiàn)核膜BK通道在神經(jīng)元的興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)過程中,介導(dǎo)了神經(jīng)活動引起的核鈣信號活動以及基因表達(dá),那么接下來我們就探討了核膜BK通道及核鈣信號是否調(diào)節(jié)了樹突分支。首先,為了驗證細(xì)胞核鈣信號是否參與了對神經(jīng)元樹突分支的調(diào)節(jié),我們對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒使其過表達(dá)兩種蛋白,一是CaMBP4,它能夠競爭性地阻止CaM與鈣離子的結(jié)合,阻斷鈣信號活動對CaMKIV信號通路的激活；另一個是前文提到過的dnCaMKIV,它通過顯性負(fù)性作用減弱CaMKIV的作用。通過這兩種手段阻斷細(xì)胞核鈣信號通路的作用,我們使用sholl分析方法發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的樹突分支復(fù)雜程度降低了,同時樹突總長度也有降低(CaMBP4組P=0.044, dnCaMKIV組P=0.022)。這表明神經(jīng)元細(xì)胞核鈣信號確實參與對樹突分支的調(diào)節(jié)。為了探討核膜BK通道是否參與對樹突分支的調(diào)節(jié),我們將神經(jīng)元用IbTx預(yù)處理以排除細(xì)胞膜BK通道的影響之后,給予pxilline以阻斷核膜BK通道。sholl分析方法顯示樹突分支的復(fù)雜程度有所增加,而樹突總長度也有顯著性增加(t=-2.700,P=0.010),這表明核膜BK通道參與對樹突分支的調(diào)節(jié)。為了證明核膜BK通道是通過調(diào)控核鈣信號來影響樹突分支的,我們對外源表達(dá)CaMBP4和dnCaMKIV的神經(jīng)元使用paxilline,但paxilline并沒有增加樹突分支的復(fù)雜程度或總長度,相反,神經(jīng)元樹突分支的復(fù)雜程度或總長度顯著降低,這證明paxilline對樹突分支的復(fù)雜程度或總長度的促進(jìn)作用是通過CaMKIV依賴性的核鈣信號介導(dǎo)的。為了進(jìn)一步驗證BK通道對樹突分支的作用,排除paxilline藥物非特異性的可能,我們使用shRNA減少BK通道的表達(dá),發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元樹突分支復(fù)雜程度與總長度均有增加(t=-3.424,P=-0.002),與paxilline的效果是一致的。STO-609既可以降低神經(jīng)元基礎(chǔ)水平下的樹突分支復(fù)雜程度與總長度(t=-4.32,P=0.000),也能逆轉(zhuǎn)BK通道的干擾shRNA帶來的樹突分支復(fù)雜程度和總長度的增加(t=7.99,P=0.000),進(jìn)一步說明核膜BK通道是通過核鈣信號來調(diào)節(jié)樹突分支的。為了闡明核膜BK通道是否通過調(diào)控其下游基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)樹突分支,我們首先在核膜BK通道調(diào)控的基因中篩選了可能參與調(diào)節(jié)樹突分支的基因。我們分別設(shè)計了一系列shRNA來干擾Fos, Npas4, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b這些核膜BK通道的下游基因的表達(dá),并通過sholl分析方法檢測神經(jīng)元樹突分支的復(fù)雜程度,檢測樹突總長度。我們的數(shù)據(jù)表明,在這六個下游基因當(dāng)中,抑制Fos, Atf3, Btg2, Bcl6,以及Ifi206b的表達(dá)都沒有影響樹突分支復(fù)雜程度或者總長度,而當(dāng)Npas4基因的表達(dá)被干擾,樹突分支的復(fù)雜程度顯著降低,樹突總長度也下降(P=0.008)。這提示在核膜BK通道調(diào)控的下游基因中,Npas4可能介導(dǎo)了核膜BK通道對樹突分支的影響。為了進(jìn)一步證明核膜BK通道是通過Npas4來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突分支的,我們給培養(yǎng)神經(jīng)元用IbTx預(yù)處理后,給予paxilline抑制核膜BK通道,并用上述shRNA干擾Fos, Npas4, Atf3, Btg2,Bcl6,以及Ifi206b的表達(dá),我們發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)Npas4基因的表達(dá)被抑制,paxilline誘導(dǎo)的樹突分支的復(fù)雜程度及樹突總長的的增加被逆轉(zhuǎn)(P=0.000),而干擾其他基因表達(dá)均沒有對paxilline的作用產(chǎn)生影響。這些結(jié)果說明,核膜BK通道是通過抑制Npas4基因的表達(dá)來調(diào)節(jié)神經(jīng)元的樹突分支的。上述結(jié)果表明,核膜BK通道的一個生理功能是將神經(jīng)元的突觸活動與細(xì)胞核鈣信號耦聯(lián)起來,進(jìn)而調(diào)節(jié)突觸信號從神經(jīng)元樹突向細(xì)胞核內(nèi)的傳遞過程。我們的研究揭示核膜BK通道是細(xì)胞核膜上調(diào)節(jié)神經(jīng)活動依賴性核鈣信號的一個新的調(diào)節(jié)因子。以上實驗數(shù)據(jù)用X±SD進(jìn)行描述,統(tǒng)計分析采用獨(dú)立樣本t檢驗及One-way ANOVA,實驗數(shù)據(jù)分為兩個組的采用了獨(dú)立樣本t檢驗,實驗數(shù)據(jù)分為三個組或更多的采用了One-way ANOVA,在One-way ANOVA的兩兩比較中,方差齊時采用LSD檢驗,方差不齊時采用Dunnett's T3檢驗,P0.05被認(rèn)為具差異有統(tǒng)計學(xué)意義。統(tǒng)計軟件為SPSS 13.0。
【關(guān)鍵詞】：離子通道 核鈣信號 BK通道 樹突分支
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q42;Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-11
• ABSTRACT11-18
• 前言18-24
• 材料和方法24-35
• 結(jié)果35-71
• 討論71-76
• 參考文獻(xiàn)76-82
• 綜述82-91
• 參考文獻(xiàn)88-91
• 致謝91-92
• 論文發(fā)表情況92-94
• 統(tǒng)計學(xué)證明94

，

本文編號：796517