本文關(guān)鍵詞：RNA-Seq結(jié)合基因網(wǎng)絡(luò)分析揭示水稻種子萌發(fā)的復(fù)雜調(diào)控過程

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【摘要】：種子萌發(fā)一般是指從種子休眠到植株生長的一個過渡階段,是植物新一輪生命周期的開始。水稻是世界上最重要的農(nóng)作物之一,而且其全基因組序列早已公布,研究水稻種子的萌發(fā)有利于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和后續(xù)研究。隨著基因測序技術(shù)和“組學(xué)”的快速發(fā)展,全轉(zhuǎn)錄組測序成為了研究種子萌發(fā)的新工具,但至今仍缺乏相關(guān)研究。種子萌發(fā)的調(diào)控機制雖有相關(guān)報道,但對于萌發(fā)中多個調(diào)控因素共同調(diào)控的整個過程還有待進(jìn)一步研究。為了從整個轉(zhuǎn)錄組水平研究水稻種子萌發(fā)的過程,我們基于新一代測序平臺SOLiD,對粳稻日本晴(Oryza sativa L. japonica. cv. Nipponbare)種子浸水0(干燥)、12和48(萌發(fā))h(hour post imbibition,HPI)的胚進(jìn)行了RNA-Seq研究�；诘玫降�83,273,725,71,036,373和90,085,278個reads,我P在0,12和48 HPI分R%檢n,到了27,847,30,173和30,934個表達(dá)基因,這初步說明種子萌發(fā)過程中轉(zhuǎn)錄活動的增加。差異表達(dá)基因分析顯示在萌發(fā)早期(0-12 HPI)發(fā)生顯著變化的基因(6,911)明顯多于后期(12-48 HPI)變化的基因(3,083),表明浸水前12 h是萌發(fā)過程中的重要階段�；蚬δ芊治霰砻髅劝l(fā)過程中發(fā)生了不同的分子生物學(xué)事件。例如,表觀修飾、內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生和碳水化合物結(jié)合相關(guān)基因分別在0,12和48 HPI富集。代謝分析表明萌發(fā)前期激活了基本的代謝活動,如淀粉相關(guān)代謝及細(xì)胞壁修飾相關(guān)基因表達(dá)量顯著增加,有利于種子進(jìn)一步吸水；后期脂類和氨基酸代謝以及光合作用代謝相關(guān)表達(dá)增加,為萌發(fā)后的植株生長作準(zhǔn)備。水稻種子特異基因,尤其胚胎發(fā)育晚期豐富蛋白(late embryo abundant,LEA),熱激蛋白(heat shock protein 20,HSP20)及種子儲存蛋白的編碼基因,在萌發(fā)中表達(dá)量呈下降趨勢。LEAs和HSPs在干燥種子中積累可以保護(hù)胚,在吸水后顯著下降是適應(yīng)環(huán)境的種表現(xiàn)。儲存蛋白在吸水后被降解,可能為萌發(fā)過程和后期生長提供了代謝中間物和能量。植物激素在種子萌發(fā)中具有重要作用,但所有植物激素及它們之間的關(guān)系對萌發(fā)的整體調(diào)控尚未報道。本研究中,我們搜集了八種植物激素的合成和信號通路相關(guān)基因,包括脫落酸(abscisic acid, ABA)、赤霉素(gibberellin, GA)、油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)、乙烯(ethylene, ET)、細(xì)胞分裂素(cytokinin, CK)、生長素(auxin)、茉莉酸(jasmonic acid, JA)和水楊酸(salicylic acid, SA).植物激素相關(guān)基因表達(dá)量的增加/降低趨勢某種程度上代表了植物激素對萌發(fā)的/正/負(fù)調(diào)控,表達(dá)譜分析結(jié)果證實ABA和GA為萌發(fā)的負(fù)調(diào)控和正調(diào)控激素,BR也可能為萌發(fā)正調(diào)控激素,另外幾種植物激素的表達(dá)譜趨勢不明顯,不能預(yù)測其在萌發(fā)中的作用。為了研究植物激素之間的相互作用,我們進(jìn)行了相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析。網(wǎng)絡(luò)前十個核心基因中有六個編碼磷酸化相關(guān)蛋白,表明磷酸化在植物激素及萌發(fā)調(diào)控中的重要作用。比如,BR與ABA途徑通過磷酸化相關(guān)的BR不敏感基因2(BR insensitive 2,BIN2)和蛋白磷酸酶2C基因(protein phosphatase 2C,PP2C)相連接,推測BR可能通過BIN2磷酸化PP2C從而抑制ABA的信號傳導(dǎo)。其他植物激素如SA,可能與脅迫中的萌發(fā)過程相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor,TF)通過結(jié)合順式作用元件(cis-element)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄。對收集的TF基因進(jìn)行層次聚類,結(jié)果與整體基因的表達(dá)模式一致,可能在萌發(fā)中起調(diào)控作用。統(tǒng)計分析TF基因表達(dá)模式,可將TF分成三類在三個時間點富集的家族。根據(jù)共表達(dá)基因網(wǎng)絡(luò)和GO分析,構(gòu)建TF家族的功能網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)三類富集TF家族與該時期的功能變化密切相關(guān)。比如,0 HPI富集的PHD、SET和SNF2等TF家族與干燥種子中的表觀修飾相關(guān)；12 HPI富集的HD-ZIP和M-type等家族與吸水后的內(nèi)部結(jié)構(gòu)形態(tài)發(fā)生相關(guān);48 HPI富集的WRKY、AUX/IAA和NAC等家族與脂類代謝和光合作用相關(guān)。結(jié)合公共數(shù)據(jù),我們在水稻胚中鑒定了35個萌發(fā)特異的TF基因。因為12 HPI表達(dá)量最高的基因即為最可能在萌發(fā)中起調(diào)控作用的基因,所以從中隨機選取7個TF基因,進(jìn)行qRT-PCR驗證。實驗結(jié)果基本與RNA-Seq數(shù)據(jù)表達(dá)模式一致,這為以后的功能實驗研究提供了參考基因。順式作用元件通過與TF結(jié)合調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。我們統(tǒng)計了各時期高表達(dá)基因中富集的順勢作用元件,結(jié)果顯示ABRE(ABA responsive element),GARE(GA responsive element)和光反應(yīng)相關(guān)元件分別在0,12和48 HPI富集,這與ABA和GA相關(guān)基因的表達(dá)變化和萌發(fā)中的生理過程一致�？傮w來說,本研究分析了水稻種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)錄組及功能變化,揭示了萌發(fā)是植物激素和轉(zhuǎn)錄因子等多種因素共同調(diào)控的復(fù)雜過程。結(jié)果同時表明磷酸化在植物激素相互作用中的重要性,并暗示了表觀調(diào)控在控制種子休眠中的潛在作用。
【關(guān)鍵詞】：種子萌發(fā) 水稻 RNA-Seq 調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)分析
【學(xué)位授予單位】：中國科學(xué)院北京基因組研究所
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q943.2
【目錄】：

• 致謝5-7
• 摘要7-9
• ABSTRACT9-12
• 專業(yè)詞匯中英文對照表12-19
• 1 引言19-42
• 1.1 DNA測序技術(shù)19-24
• 1.1.1 新一代測序技術(shù)及原理19-23
• 1.1.1.1 SOLiD測序平臺20-23
• 1.1.2 三代測序技術(shù)比較23-24
• 1.2 基于新一代測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序24-28
• 1.2.1 RNA-Seq技術(shù)25-26
• 1.2.2 RNA-Seq數(shù)據(jù)分析流程26-28
• 1.3 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)28-30
• 1.3.1 分子生物學(xué)相關(guān)網(wǎng)絡(luò)28
• 1.3.2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)28-29
• 1.3.3 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和應(yīng)用29-30
• 1.4 種子萌發(fā)及其研究意義30-33
• 1.4.1 植物的種子30
• 1.4.2 種子萌發(fā)的定義和生物學(xué)過程30-32
• 1.4.2.1 種子萌發(fā)的定義30-31
• 1.4.2.2 種子萌發(fā)的生物學(xué)過程31-32
• 1.4.2.3 種子萌發(fā)過程中的轉(zhuǎn)錄和翻譯32
• 1.4.3 種子萌發(fā)的研究意義32-33
• 1.5 種子萌發(fā)的調(diào)控33-40
• 1.5.1 種子發(fā)育相關(guān)蛋白33
• 1.5.2 植物激素對種子萌發(fā)的調(diào)控33-37
• 1.5.2.1 脫落酸(ABA)34
• 1.5.2.2 赤霉素(GA)34-35
• 1.5.2.3 油菜素類固醇(BR)35
• 1.5.2.4 乙烯(ET)35-36
• 1.5.2.5 生長素(Auxin)36
• 1.5.2.6 細(xì)胞分裂素(CK)36
• 1.5.2.7 茉莉酸(JA)36-37
• 1.5.2.8 水楊酸(SA)37
• 1.5.3 轉(zhuǎn)錄因子對種子萌發(fā)的調(diào)控37-39
• 1.5.3.1 植物中的轉(zhuǎn)錄因子家族37-38
• 1.5.3.2 植物激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子38
• 1.5.3.3 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫38-39
• 1.5.4 順式作用元件39-40
• 1.5.4.1 順式作用元件的種類39
• 1.5.4.2 順式元件相關(guān)網(wǎng)站和軟件39-40
• 1.6 水稻種子萌發(fā)的研究進(jìn)展40-41
• 1.6.1 水稻的研究價值40
• 1.6.2 水稻種子萌發(fā)的研究進(jìn)展40-41
• 1.7 本課題的研究意義41-42
• 2 材料與方法42-47
• 2.1 取材和測序42
• 2.1.1 水稻種子的萌發(fā)42
• 2.1.2 總RNA和mRNA的提取42
• 2.1.3 文庫構(gòu)建和測序42
• 2.2 數(shù)據(jù)處理和分析42-47
• 2.2.1 序列比對和基因表達(dá)量計算43
• 2.2.2 差異表達(dá)及層次聚類分析43-44
• 2.2.3 功能注釋44
• 2.2.4 種子發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)分析44
• 2.2.5 植物激素相關(guān)基因的表達(dá)和網(wǎng)絡(luò)分析44-45
• 2.2.5.1 植物激素途徑的基因收集及表達(dá)譜分析44
• 2.2.5.2 植物激素相關(guān)基因的表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析44-45
• 2.2.6 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)統(tǒng)計及網(wǎng)絡(luò)分析45
• 2.2.6.1 轉(zhuǎn)錄因子的基因收集45
• 2.2.6.2 轉(zhuǎn)錄因子家族的統(tǒng)計分析45
• 2.2.6.3 構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子家族的功能網(wǎng)絡(luò)45
• 2.2.7 水稻種子萌發(fā)特異轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定及驗證45-46
• 2.2.7.1 水稻種子萌發(fā)特異轉(zhuǎn)錄因子基因的鑒定45-46
• 2.2.7.2 qRT-PCR驗證46
• 2.2.8 順式作用元件的富集分析46-47
• 3 結(jié)果47-80
• 3.1 水稻種子的萌發(fā)情況47
• 3.2 萌發(fā)過程中的基因表達(dá)分析47-51
• 3.2.1 序列比對47-48
• 3.2.2 基因的表達(dá)量統(tǒng)計48-49
• 3.2.3 差異表達(dá)基因和表達(dá)變化分析49
• 3.2.4 基因的層次聚類和表達(dá)分類49-50
• 3.2.5 小結(jié)50-51
• 3.3 表達(dá)基因的功能分析51-58
• 3.3.1 表達(dá)基因的GO注釋51-54
• 3.3.2 KEGG代謝通路的相關(guān)表達(dá)54
• 3.3.3 MapMan和PageMan分析54-58
• 3.3.3.1 MapMan分析54-56
• 3.3.3.2 PageMan分析56-58
• 3.3.4 小結(jié)58
• 3.4 水稻種子發(fā)育相關(guān)蛋白的基因表達(dá)58-59
• 3.4.1 SeedGeneDB中水稻種子基因的表達(dá)58-59
• 3.4.2 小結(jié)59
• 3.5 植物激素相關(guān)基因的表達(dá)及網(wǎng)絡(luò)分析59-64
• 3.5.1 植物激素相關(guān)基因及通路整理59-60
• 3.5.2 植物激素相關(guān)酶的基因表達(dá)60-61
• 3.5.3 植物激素相關(guān)基因的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)61-63
• 3.5.4 小結(jié)63-64
• 3.6 轉(zhuǎn)錄因子(TF)的基因表達(dá)及功能網(wǎng)絡(luò)64-72
• 3.6.1 轉(zhuǎn)錄因子的層次聚類及表達(dá)分類64-66
• 3.6.2 轉(zhuǎn)錄因子家族的表達(dá)分組66-69
• 3.6.3 轉(zhuǎn)錄因子的功能網(wǎng)絡(luò)69-71
• 3.6.4 小結(jié)71-72
• 3.7 水稻種子萌發(fā)特異TF基因的篩選及qRT-PCR驗證72-76
• 3.7.1 篩選種子萌發(fā)特異TF基因72-75
• 3.7.2 qRT-PCR驗證75
• 3.7.3 小結(jié)75-76
• 3.8 順式作用元件的富集分析76-80
• 3.8.1 小結(jié)79-80
• 4 總結(jié)80-82
• 參考文獻(xiàn)82-92
• 附錄92-103
• 作者簡介及在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果103

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1 崔o，

本文編號：790442